Nachweis und Quantifizierung Defensin-positiver Zellen im subepithelialen Ileum von Morbus Crohn-Patienten unter immunsuppressiver Therapie

Abstract

Der menschliche Darm kommt über die Nahrung täglich mit einer Vielzahl verschiedenster Keime in Kontakt. Um auf diese adäquat reagieren zu können, ist einerseits eine intakte mukosale Barriere wichtig, andererseits aber auch die gezielte Aktivierung passiver sowie aktiver Abwehrmechanismen sowie die Toleranz gegenüber endogenen Kommensalen zur Vermeidung überschießender Immunreaktionen. Eine wesentliche Rolle bei der mukosalen Immunabwehr spielen die Defensine. Diese antimikrobiellen Peptide werden auf Organoberflächen exprimiert und tragen als sogenannte „körpereigene Antibiotika“ im Darm wesentlich zur Aufrechterhaltung der intestinalen Mukosabarriere bei. Alpha- Defensin 5 und 6 (α5, α6) werden hauptsächlich von Panethzellen der Ileumschleimhaut konstitutiv exprimiert, wobei eine verminderte Expression im Ileum bei Vorliegen eines Morbus Crohn nachgewiesen wurde. Beta-Defensin 2 (β2), vorrangig von Enterozyten exprimiert, wird stark hochreguliert als Antwort auf proinflammatorische Stimuli und spielt außerdem eine Rolle als Chemotaxin für Dendritische Zellen sowie Gedächtnis-T-Zellen. Ziel der vorliegenden Studie war es, Defensin-positive Zellen in der ilealen Darmwand bei Morbus Crohn-Patienten zu lokalisieren, die Unterschiede im Verteilungsmuster zur Appendizitis aufzuzeigen und den Einfluss verschiedener medikamentöser Therapien auf das Defensin-Vorkommen zu untersuchen. Für die Versuchsreihen wurden paraffinfixierte OP-Resektate von menschlicher Darmschleimhaut verwendet. Terminales Ileumgewebe von 3 Morbus Crohn- Patientengruppen unter verschiedenen präoperativen Therapieschemata (Gruppe I: Mesalazin, Gruppe II: Prednisolon, Gruppe III: Prednisolon + Azathioprin) wurde mit gesundem Ileumgewebe von Patienten mit kolorektalem Karzinom sowie Appendixgewebe von Patienten mit akuter Appendizitis verglichen. Mithilfe eines histopathologischen Bewertungssystems wurde für alle Gewebeschnitte der histologische Entzündungsgrad bestimmt (Punktevergabe von 0 bis 4, wobei 0 keiner Entzündung und 4 der schwersten Entzündungsstufe entspricht). Mittels Immunfluoreszenz erfolgten anschließend die Detektion von α5, α6 und β2 sowie die Bestimmung der prozentualen Menge Defensin-positiver Zellen in der Lamina propria. Patienten mit Morbus Crohn wiesen im Vergleich zur Kontrollgruppe unabhängig von Art und Dauer ihrer medikamentösen Therapie in der Lamina propria des betroffenen Ileumabschnitts eine erhöhte Menge an α5-, α6- und β2-positiven Zellen auf, wobei die Menge mit dem Grad der Entzündung positiv korrelierte. Auch bei Patienten mit akuter Appendizitis konnten erhöhte Mengen an Defensin-positiven Zellen verglichen zur Kontrollgruppe nachgewiesen werden. Die Defensine α5 und α6 zeigten keine signifikanten Mengenunterschiede zwischen den verschieden therapierten Morbus Crohn-Gruppen. Dagegen wiesen Morbus Crohn-Patienten unter Prednisolon-Therapie signifikant höhere Mengen an β2-positiven Zellen auf als Patienten unter Mesalazin-Therapie und Patienten unter einer Kombinationstherapie aus Prednisolon und Azathioprin. Mit der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass die humanen Defensine α5, α6 und β2 auch außerhalb des Darmepithels vorkommen. Dabei konnte eine Erhöhung der Mengen Defensin-positiver Zellen unter entzündlichen Bedingungen evaluiert werden, unabhängig davon, ob es sich um eine akute oder eine chronische Darmentzündung handelt. Es wäre denkbar, dass es bei einem Morbus Crohn durch die gestörte Barrierefunktion des intestinalen Epithels, gefördert durch den relativen epithelialen Defensinmangel, vermehrt Keime in die subepithelialen Darmwandschichten eindringen und somit konsekutiv eine verstärkte Entzündungsreaktion in der Lamina propria ausgelöst wird. Diese könnte zu einer Aktivierung beziehungsweise Proliferation von (möglicherweise immunkompetenten) Zellen führen, die in der Lage sind, Defensine zu exprimieren oder zu binden, um somit die Abwehrlage des Organismus zu verbessern. Die deutlich erhöhten Mengen β2-positiver Zellen bei Patienten unter Prednisolon-Therapie implizieren Regulationswege dieses Defensins durch Kortikosteroide, die NFκB-unabhängig sind.

Background & Aims: Defensins are peptides with antimicrobial function which play a pivotal role for the maintenance of the intestinal barrier function. They are known as effectors of neutrophils, Paneth cells and different epithelia with a modified quantity in inflammatory bowel diseases. Aim of this study was the detection and quantification of defensin positive cells in the submucosal layer of Crohn’s disease (CD) affected bowel under different long term medication. Methods: We used paraffin fixed specimen of terminal ileum from patients with CD under different medical treatment prior to operation (group I: mesalazine, group II: prednisolone, group III: prednisolone + azathioprine), appendix resections from patients with acute appendicitis and ileac tissue from controls to perform immunofluorescence for identifying the human defensins α5, α6 and β2 in the lamina propria. Results: Patients with CD showed a significant increased amount of defensin positive cells in the affected ileum compared to non-inflamed tissue independent of kind and duration of their medical treatment, indicating that the amount increased with the degree of histological inflammation. Furthermore, we found significant higher amounts of β2 positive cells in CD patients under single prednisolone therapy in comparison to mesalazine treated CD patients and those under combined therapy of prednisolone and azathioprine, whereas α5 and α6 did not present any value differences between the different CD groups. Conclusions: The increase of cells expressing or binding defensins in the inflamed ileac lamina propria of CD patients implies a consecutive response to bacterial invasion of the subepithelial layer caused by intestinal barrier dysfunction.