Interventions- und Präventionsstudien mit kombinierten ECE/NEP-Hemmern an Schlaganfallmodellen in Ratten

Abstract

Verschiedene Abläufe spielen sich nach einem Schlaganfall gleichzeitig in dem betroffenen Gebiet ab. Es kommt zu einem Abfall des zerebralen Blutflusses, einer Entzündungsreaktion, die Permeabilität der Blut-Hirn Schranke wird verändert und eine Apoptose und Nekrose der Gehirnzellen findet statt. In den ischämischen Gehirngebieten kommt es zu einer deutlich erhöhten Endothelin-1 Konzentration, einer der potentesten Vasokonstriktoren, und einer vermehrten Expression entsprechender Rezeptoren. Eine anti-inflammatorische und neuroprotektive Wirkung von Endothelin- Antagonisten wurde bereits in der Literatur beschrieben. Vasodilatative und anti-inflammatorische Eigenschaften werden auch den natriuretischen Peptiden zugeschrieben. Um deren positive Eigenschaften nach einem Schlaganfall zu nutzen und auf Grund der oben erwähnten Ergebnisse, wurde in dieser Arbeit der protektive Effekt eines Endothelin-converting-enzym-/ Neutrale Endopeptidase- Antagonisten (ECE/NEP Blocker), SLV 338, in verschiedenen Schlaganfallmodellen in der Ratte getestet. In Studie A wurden die Ratten 5 Tage vor einer Schlaganfalloperation (middle cerebral artery occlussion (MCAO)) über eine subkutane Minipumpe mit SLV338 oder Lösungsmittel (PBS) behandelt, in Studie B wurden die Ratten im Anschluss an die MCAO Operation über eine Minipumpe IV mit SLV338, PBS, SLV334 (eine bereits getestete Substanz mit SLV338 ähnlicher, aber weniger potenten Wirkweise) oder Glukoselösung behandelt. Von allen Tieren wurde der Blutdruck, die neurologischen Defizite nach der MCAO Operation und das Infarktvolumen ermittelt. Im dritten Versuch, der Studie C, wurden 8 Wochen alte spontaneously hypertensive rats-stroke-prone (SHR-SP) auf Hochsalzdiät gesetzt; gleichzeitig erhielten 2 der 3 Gruppen über das Futter eine Behandlung mit 30 oder 100 mg/kg SLV338. Die Tiere erlitten auf Grund genetischer Disposition und der Salzdiät spontane Schlaganfälle. Der Blutdruck, die neurologischen Defzite, das Körpergewicht, Trinkwasser- und Futteraufnahme, Urinvolumen, Blutparameter und Urinparameter wurden während der Studie zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Zusätzlich wurden die entnommenen Gehirne aller Tiere auf Schlaganfälle hin untersucht und die Mortalität in den unterschiedlichen Gruppen ermittelt. Bei keinem der behandelten Tiere traten Nebenwirkungen durch die Gabe von SLV338 auf. In Studie A und B konnten keine Unterschiede in den erhobenen Parametern zwischen den behandelten Tieren und der Kontrollgruppe festgestellt werden. In Studie C konnte eine deutliche Verzögerung der Albuminurie in den behandelten Gruppen beobachtet werden und eine signifikante, blutdruckunabhängige Verringerung der Schlaganfallinzidenz und damit auch der Mortalität. Besonders deutlich war diese Reduktion in der niedrig dosierten Gruppe, aber auch in der höher dosierten Gruppe konnte dieser Effekt beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass Endothelin-1 und die natriuretischen Peptide bei der Entstehung eines Schlaganfalls eine wichtige Rolle spielen, später jedoch, bei den Abläufen, die nach einem Schlaganfall auftreten, keinen Einfluss mehr haben. Die Wirkung von SLV338, eine deutliche Reduktion der Schlaganfallinzidenz, scheint auf einen vasoprotektiven Effekt zurückzuführen zu sein. Die Blockade des ECE und der NEP könnte so einen neuen therapeutischen Ansatz in der primären Schlaganfallprävention und der Verbesserung der Mortalität bieten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des Lösungsmittels auf das am häufigsten gebrauchte Tiermodell in der Schlaganfallforschung, der middle cerebral artery occlusion (MCAO), getestet. Bei diesem Modell werden im Anschluß an die operative Schlaganfallinduktion verschiedene Parameter, z.B. das Schlaganfallvolumen, die neurologischen Defizite und das Allgemeinbefinden, einer mit neuer Substanz behandelten Gruppe mit einer nur mit Lösungsmittel behandelten Kontrollgruppe verglichen. Der Einfluss verschiedener Faktoren, wie z.B. Operationstechnik, Anästhesie und Rattenstamm auf diese Parameter ist bekannt und veröffentlicht, der Einfluss des Lösungsmittels selber ist allerdings bisher noch nicht untersucht worden. In dieser Arbeit wurden 3 verschiedene häufig genutzte Lösungsmittel, PBS, 5% Glukoselösung und physiologisches NaCl, miteinander verglichen. Dafür wurden männlichen Wistar-Ratten im Anschluss an die MCAO Operation über 2 Tage IV über eine Minipumpe mit einem der Lösungsmittel behandelt. Die neurologischen Defizite, das Körpergewicht und die Infarktgröße wurden ermittelt. Anschließend wurden die Gehirne von allen Tieren entnommen, im Kryostaten geschnitten, gefärbt und die Neuronen auf der ipsi- und kontralateralen Seite unter dem Fluoreszenzmikroskop gezählt und verglichen. In allen ermittelten Parametern wies die mit PBS behandelte Gruppe, im Vergleich zu den anderen zwei Behandlungsgruppen, bessere Ergebnisse auf. Besonders deutlich konnte dies in der Mortalität beobachtet werden; in der mit PBS behandelten Gruppe lag die Mortalität bei 25%, in der mit Glukose behandelten Gruppe bei 38.5% und in der mit NaCl behandelten Gruppe bei 53%. Diese Ergebnisse zeigen einen wesentlichen Einfluss des Lösungsmittels auf das Auskommen nach einer MCAO Operation und es wird deutlich, wie wichtig es für eine Vergleichbarkeit zwischen den Gruppen ist das gleiche Lösungsmittel zur Lösung der zu testenden Substanz und zur Behandlung der Referenzgruppe einzusetzen.

Different parallel processes happen after stroke in the ischemic area: the cerebral blood flow decreases, an inflammation appears, permeability of the blood-brain barrier changes and apoptosis and necrosis of brain cells occurs. In the ischemic area, a significant increase of the endothelin-1 concentration, one of the most potent vasoconstrictors, is measurable and corresponding receptors are increasingly expressed. An anti-inflammatory and neuroprotective effect of endothelin antagonists was described in literature previously. Vasodilative and anti-inflammatory effects were also described for the natriuretic peptides. To use their positive properties after stroke and based on above-mentioned findings, the protective effect of a combined endothelin- converting- enzyme/ neutral endopeptidase blocker (ECE/ NEP blocker), SLV338, was tested in different stroke models in rats. In study A, 5 days before stroke operation (middle cerebral artery occlusion (MCAO)), rats were treated subcutaneously over a minipump with SLV338 or vehicle (PBS), in study B, rats were treated intravenously, immediately after MCAO, over a minipump with either SLV338, PBS, SLV334 (an already tested substance with similar effects but not as potent as SLV338) or glucose solution. Blood pressure, neurological outcome after MCAO (24 and 48 h) and infarct volume (48 h) were evaluated of all animals. In study C, 8 weeks old spontaneously hypertensive rats, stroke-prone were put on high salt diet; in 2 of 3 groups the food additionally contained either 30 or 100 mg SLV338/kg BW. Due to genetic disposition and the high salt diet, rats developed spontaneous strokes. Blood pressure, neurological outcome, body weight, water and food intake, urine volume, blood and urinary parameters were evaluated during the study at different time points. Additionally, removed brains were investigated in the MRI (magnet resonance imaging) for brain infarcts and mortality was evaluated in the different groups. In none of the treated animals side effects due to SLV338 treatment were observed. In study A and B, no differences in the parameters evaluated were determined between groups. In study C, a considerably retardation of albuminuria was observed in the treated groups as well as a significant, blood pressure independent reduction of stroke and therefore also of mortality. This finding was more obvious in the group treated with the low dose of SLV338, but was also observed in the group treated with 100 mg/kg SLV338. The results of these studies indicate a high influence of endothelin and the natriuretic peptides on the development of stroke, but only a minor influence on the processes happening after stroke. The significant reduction of stroke seems to be related to a vasoprotection due to SLV338 treatment. Thus, the combined ECE/ NEP inhibition could offer a new therapeutic approach in primary stroke prevention and improvement of mortality. In the second part of this work, the influence of the vehicle on the most frequently used animal model in stroke research, the middle cerebral artery occlusion (MCAO), was determined. In this model of experimental induced stroke, a potentially new therapeutic agent is generally tested in comparison to a group treated solely with the vehicle. The influence of different parameters, like occlusion technique, anaesthetic or rat strain, on the outcome after MCAO has been previously described in literature, but the influence of the vehicle itself has not yet been assessed. This study investigates the influence of three different frequently used vehicles, PBS, 5% glucose solution or NaCl, on outcome after experimental stroke. Therefore, male Wistar rats were treated intravenously over 2 days after MCAO with one of the vehicle solutions. Neurological outcome, body weight and infarct sizes were assed of all animals. Thereafter, brains were removed; cut into slices using a cryostat, stained and neurons were counted under a fluorescence microscope on the ipsi- and contralateral side and compared. Results of the group treated with PBS were in all evaluated parameters slightly better when compared to the other two treatment groups. This was plainest in mortality: mortality was 25% in the PBS treated group, 38.5% in the glucose treated group, and 53% in the NaCl treated group. These findings strongly indicate a certain influence of the vehicle on the parameters evaluated in this study and underline the importance of using the very same vehicle