Untersuchungen zur Pathogenese der Mitochondriopathien anhand ausgesuchter Patienten und eines Mausmodells für den mitochondrialen Komplex I-Mangel

Abstract

Mitochondriopathien sind eine Gruppe meist genetisch bedingter Multisystemerkrankungen, die durch Störungen des mitochondrialen Energiemetabolismus infolge von Mutationen in der mitochondrialen oder nukleären DNA auftreten. Ihre Klinik ist sehr heterogen und umfasst ein weites Symptomenspektrum, wobei das Gehirn und die Muskeln aufgrund ihres hohen aeroben Energiebedarfs besonders häufig involviert sind (Epilepsie, Ataxie, Myopathie). Die genaue Pathogenese der Mitochondriopathien ist bisher nur in Ansätzen verstanden. Diese Arbeit widmete sich der Untersuchung der charakteristischen regionalen Pathologie einzelner Organe und Gewebe sowie der Suche nach individuellen genetischen Faktoren, die einen Einfluss auf die klinische Variabilität der Erkrankungen haben könnten. Darüber hinaus sollte ein Mausmodell für in vivo Studien zur Pathogenese einer bestimmten Mitochondriopathie (Komplex I-Defizienz) generiert werden. Die Untersuchungen zur regionalen Pathologie der Mitochondriopathien erfolgten exemplarisch an einer Patientin mit der m.8344A->G MERRF-Mutation. An den Biopsieproben 43 verschiedener Gewebe der Patientin konnte ich durch quantitative Pyrosequenzierung der mtDNA, gewebsspezifische Unterschiede der Mutationslast als Ursache der bevorzugten Betroffenheit ihrer Muskulatur und einzelner Gehirnareale ausschließen. Anhand von Untersuchungen mittels quantitativer real-time PCR zeigte sich jedoch, dass betroffene Gehirnregionen und Muskeln gegenüber symptomfreien Geweben eine massive Erhöhung der mtDNA-Kopienzahlen aufwiesen. Eine solche Erhöhung könnte im Zusammenhang mit einer verstärkten Mitochondrienbiogenese stehen, welche den mutationsbedingten Energiemangel in den Zellen kompensieren könnte. Bestätigung fand diese Hypothese jedoch nur in der klinisch betroffenen Skelettmuskulatur, in welcher ich eine parallele Erhöhung der Mitochondrienmasse sowie der Mengen des mitochondrialen Transkriptionsfaktors TFAM und des mitochondrial kodierten Proteins COX2 nachweisen konnte. Die dennoch gestörte Muskelfunktion erklärt sich vermutlich durch das von mir nachgewiesene Ungleichgewicht zwischen mitochondrial und nukleär kodierten Strukturproteinen der Mitochondrien. In den betroffenen Gehirnregionen fand ich keine konsistenten Hinweise auf eine verstärkte Mitochondrienbiogenese. Den Einfluss individueller genetischer Faktoren auf die klinische Ausprägung mitochondrialer Mutationen habe ich in dieser Arbeit an einem Patienten mit einem komplexen Phänotyp dargestellt. Die progressive Muskelschwäche und Belastungsintoleranz des Patienten sprachen zunächst für einen mitochondrialen Ursprung der Erkrankung. Dies schien durch die Identifizierung einer heteroplasmischen Mutation (m.8347A->G) im mitochondrialen tRNALys-Gen bestätigt. Untypisch für mitochondriale Mutationen war jedoch der pathologisch differenzierte Augenphänotyp des Patienten mit atypischer Aniridie, Katarakt, Nystagmus, Ptosis und Hornhautmissbildungen, was darüber hinaus zur Identifizierung einer heterozygoten 16 bp-Deletion im kernkodierten PAX6-Gen führte. Beide Mutationen wurden zuvor noch nicht beschrieben. In dieser Arbeit diskutiere ich die Pathogenität der beiden Mutationen, die Wahrscheinlichkeit für ihr paralleles Auftreten und einen möglichen Einfluss der PAX6-Mutation auf die mtDNA-Mutationsrate. Die Generierung eines Mausmodells mit einer Defizienz des mitochondrialen Atmungskettenkomplexes I sollte in vivo Untersuchungen zur Pathogenese von Mitochondriopathien in dieser Arbeit ermöglichen. Über eine konventionelle gene targeting-Strategie habe ich die Missense-Mutation c.1022C->T in das Ndufv1-Gen, welches die NADH-bindende Untereinheit des Komplexes I kodiert, eingeführt. Diese Mutation war zuvor bei einer Patientin gefunden worden, die mit ihrer Krankheit bis in das jugendliche Alter überlebte. In den manipulierten embryonalen Mausstammzellen kam es jedoch unbeabsichtigt zur Entstehung einer zweiten Missense-Mutation auf demselben Allel. Homozygote Mausmutanten starben noch während der Embryonalentwicklung, und elektronenmikroskopisch konnte ich am Tag E8,5 eine beginnende Auflösung der Zell-Zell-Kontakte sowie abnorme Mitochondrienstrukturen identifizieren. Heterozygote Tiere waren hingegen phänotypisch völlig normal. Die Kultivierung embryonaler Mausfibroblasten aus den Ndufv1mut/mut-Embryonen ermöglichten in vitro die Identifizierung eines isolierten Komplex I-Mangels als Folge der gestörten Ndufv1-Funktion, welche eine Umstellung des zellulären Energiestoffwechsels von aerober auf die anaerobe Glykolyse mit erhöhter Laktatproduktion nach sich zog. Die kultivierten Zellen können dementsprechend zukünftigen Studien zur Pathogenese eines Komplex I-Mangels dienen.

Mitochondriopathies are a group of predominantly inherited multisystem disorders that occur as a result of a dysfunctional oxidative energy metabolism of the mitochondria due to mutations of mtDNA or gDNA encoded mitochondrial proteins. The clinical phenotype of the patients comprises a wide symptom spectrum. Because of their high energy demand, brain and muscle tissues are primarily affected (epilepsy, ataxia, myopathy). Until now the pathogenetic mechanisms of mitochondriopathies are poorly understood. This work describes the investigations aimed to uncover the mechanisms leading to the characteristically regionalized pathology in specific organs and tissues. Furthermore it describes the discovery of an individual genetic factor that influenced the clinical phenotype of a patient with a mitochondrial tRNA mutation. Finally, I report on the generation of a knock-in mouse model that should enable us to study the pathogenesis of mitochondriopathies in vivo. The investigations of the regionalized pathology of mitochondriopathies were done in the organs of a female patient with a MTTK m.8344A->G mutation who had died from MERRF syndrome. By quantitative pyrosequencing of the mtDNA of 43 post mortem biopsy specimes of different tissues, I detected no tissue specific differences in the mutation load (degree of heteroplasmy) for the MTTK mutation. Thus I could exclude varying mutation loads as a reason for the selective affection of her skeletal muscles and specific brain regions. However, in contrast to asymptomatic tissues, the affected organs showed a massive increase of mtDNA copy numbers as determined by quantitative real-time PCR. Such an increase could be associated with an increase of mitochondrial mass through de novo biogenesis aiming to compensate for the ATP deficiency caused by the mutation. I was able to confirm this hypothesis only for the skeletal muscle of the patient. There the increase of mtDNA copy number was paralleled by an increase of the mitochondrial mass, higher protein levels of the mitochondrial transcription factor A (TFAM) and of the mtDNA encoded structural protein COX2. Nevertheless, the muscle did not entirely compensate the OXPHOS deficiency, possibly through an imbalance between mtDNA and gDNA encoded structural proteins. Within the affected brain regions I did not find a consistent evidence for an increased mitochondrial biogenesis. The influence of individual genetic factors on the clinical phenotype caused by mtDNA mutations was illustrated by the description of a patient with a complex phenotype. The progressive muscle weakness and exercise intolerance of the patient argued in favour of a mitochondrial cause of his disease. This seemed to be vindicated by the discovery of a heteroplasmic mutation (m.8347A->G) in the mitochondrial tRNALys gene. However, the eye-phenotype of the patient with atypic aniridia, cataract, nystagmus, ptosis and corneal malformation led to the discovery of a heterozygous 16 bp deletion of the nuclear encoded PAX6 gene. Both mutations had not been described before. In this thesis I discuss the pathogenicity of both mutations, the probability of their joint occurrence and a potential influence of the PAX6 mutation on the mtDNA mutation rate. Finally, I describe the generation of a knock-in mouse model for complex I deficiency which should enable us to investigate the pathogenesis of mitochondriopathies in vivo. By a conventional gene targeting strategy I introduced the c.1022C->T missense mutation into the murine Ndufv1 gene, which encodes the NADH binding subunit of complex I and which had been described in a patient with complex I deficiency. Unfortunately, in the process arose a second Ndufv1 missense mutation while handling the mouse embryonic stem cells. Homozygous mouse mutants died during early embryonic development. By electron microscopy I identified early dissolution of the cell-cell contacts as well as abnormal mitochondrial structures on embryonic day E8.5. In contrast, heterozygous animals had a normal phenotype and were fertile. The culture of embryonic mouse fibroblasts (MEFs) from the Ndufv1mut/mut embryos allowed the identification of an isolated complex I deficiency in vitro as a result of the Ndufv1 dysfunction. This complex I deficiency caused a switch in the energy metabolism of the MEF-/- cells from oxidative to anaerobic/glycolytic with the consequence of increased lactate production. In conclusion, the cultured Ndufv1mut/mut cells could be used in the future to study the pathogenesis of mitochondrial complex I deficiency.