Untersuchungen zur konstitutiven Koexpression der NO-Synthasen und Häm- Oxygenasen mit ihrem potentiellen Zielmolekül, der löslichen Guanylylzyklase: unter besonderer Berücksichtigung der Kolokalisation in der Skelettmuskulatur

Abstract

Zahlreiche Publikation der letzten Jahre haben die Aktivierung der sGC durch NO und CO gezeigt. Dem von der sGC produzierten cGMP werden wichtige Funktionen als second messenger bei der Signaltransduktion zugeschrieben. Bisher gab es wenig systematische Untersuchungen zur Koexpression der für diese Signaltranduktionswege unerläßlichen Enzyme NOS, HO und sGC. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit die konstitutive, nicht stimulierte Signaltransduktion untersucht, an der NOS-1, NOS-3, HO-2, HO-3 und sGC beteiligt sind. Die bis auf wenige Ausnahmen nur unter pathologischen Bedingungen exprimierten NOS-2 und HO-1 wurden daher nicht berücksichtigt. Zunächst wurden in zahlreichen Organensystemen die Koexpression der Enzyme in Immunblots untersucht. Zur Differenzierung der hochhomologen Moleküle HO-2 und HO-3 wurden neue Antikörper hergestellt. Danach wurde die Kolokalisation der Enzyme in der Skelettmuskulatur mit immunhistochemischenund katalytisch- histochemischen Methoden untersucht. In Immunblots war die sGC im Kardiopulmonal-, Gastrointestinal- und Zentralnervensystem sowie in der Skelettmuskulatur von Ratten und in Skelettmuskel des Hamsters nachweisbar. Die NOS-1 kam bei Ratten in ZNS und Skelettmuskeln, die NOS-3 mit Ausnahme der Skelettmuskeln in allen Organensystem und die HO-2 mit den neu hergestellten Antikörpern mit Ausnahme des Herzens ebenfalls in allen Organsystemen vor. Mit dem anti-HO-3-Antikörper fand sich in allen verwendeten Rattenorganen und in Skelettmuskeln von Hamstern ein Protein, das nicht dem erwarteten Mr von 34 kDa entsprach sondern, eines von ca. 50 kDa aufweist. Nur in der Rattenniere kam ein zweites Protein mit dem erwarteten Mr vor. In der Muskulatur von C 57-Mäusen wird dieses Protein nicht exprimiert, während es in der von homozygoten NOS-1-KO-Mäusen nachweisbar ist. Die HO-3´ weist eine Oligomerisierung auf. Die Sequenzierung ist noch nicht gelungen. In der Skelettmuskulatur von Ratte und Hamster zeigt die sGC eine duale Lokalisation und kommt im Sarkoplasma und im Sarkolemm-Bereich vor, wo das Enzym mit der NOS-1 und HO-2 kolokalisiert ist. Diese Kolokalisation deutet für Skelettmuskelfasern auf einen vollständigen Signaltransduktionsweg im Sarkolemm hin, an dem NOS-1, HO-2 und sGC beteiligt sind. Die aus Kaninchen gewonnenen anti-HO-2- und anti-HO-3-Antikörper sind zwar für den Immunblot, jedoch nicht für die Immunhistochemie geeignet. Die immunhistochemische Lokalisation der HO-2 ist mit einem kommerziellen Antikörper möglich, während über die Lokalisation der HO-3´ bisher keine Aussage getroffen werden kann. Hier sind weitereUntersuchungen zur Sequenz des Proteins und zur Lokalisation nötig.

Many publications of the last few years demonstrated the activation of sGC by NO and CO. cGMP produced by sGC plays an important role as intracellular second messenger . So far there are little systematic investigations concerning the co-expression of the enzymes NOS, HO and sGC, all of which are crucial to signal transduction. Therefore, the present study concentrates on the constitutive, non-stimulated signal transduction, which involves NOS-1, NOS-3, HO-2, HO-3 and sGC. NOS-2 and HO-1 have been neglected due to their predominant function in pathological processes.

First of all the co-expression of these enzymes in numerous organ systems was identified by immuno blots. In order to differentiate the highly homologous molecules HO-2 and HO-3 new peptide specific, polyclonal antibodies were established. Furthermore, immunohistochemistry and catalytic histochemistry in skeletal muscles investigated the co-localization of these enzymes. Immuno blots showed the existence of sGC in the cardio-pulmonary, intestinal and central nervous system as well as in skeletal muscles of rats and hamsters. NOS-1 is expressed in the central nervous system and skeletal muscles in rats, whereas NOS-3 was found in all rat organ systems with the exemption of musculature and intestines. HO-2 was absent in rat heart but found in every other system. In all rat organs and in muscles of hamsters, the new anti- HO-3-antibody detected a protein (HO-3´), whose molecular weight of 50 kDa did not comply with the expected 34 kDa. Only in rat kidney an additional protein was witnessed matching the predicted molecular weight. In muscles of C 57 mice this protein is not expressed while in homozygote NOS-1-KO mice extreme strong HO-3´-bands were found. HO-3´ shows an oligomerization. Attempts to clarify the amino acid sequence of HO-3´ were unsuccessful.

In skeletal muscles of rats and hamsters, sGC was found both in sarcoplasm and the sarcolemma region. In the latter the enzyme is co-localized with NOS-1 and HO-2. Thus, the conditions for the complete NO-CO-cGMP signal transduction pathway are fulfilled in the sarcolemma region. The peptide specific, polyclonal anti-HO-2- and anti-HO-3-antibodies are well established for immuno blot but unsuitable for immunohistochemistry. HO-2 was localized with a commercially available anti-HO-2-antibody, whilst the intracellular distribution of HO-3´ remains unclear. Therefore, further investigations concerning the localization and the amino acid sequence of HO-3´ are indicated.