Defining a function for the ion channel TRPA1

Abstract

TRPA1 is a non-selective ion channel belonging to the transient receptor potential (TRP) family. The channel is expressed by a subset of small pain sensing neurons in the peripheral nervous system and can be activated by many pain eliciting chemicals, e.g. acrolein and mustard oil. Its endogenous function remains unclear, although it is generally accepted that TRPA1 is important in the pain pathway. In my PhD project, I systematically investigated the endogenous function of TRPA1 in vitro with the help of calcium imaging and patch clamping. In initial studies, we demonstrated that TRPA1 is voltage sensitive and directly gated by intracellular calcium. Interestingly, it can be activated by several stimuli, which raise intracellular calcium levels in sensory neurons. We identified, by means of mutagenesis, an EF-hand domain in the N-terminus of TRPA1 and demonstrated that it is responsible for the calcium sensitivity of the channel. Osmotic pressure and warm temperatures did not activate the channel, but TRPA1 was secondarily activated by cold stimuli due to an increase in intracellular calcium. Thus, TRPA1 is not the cold sensor per se but potentiates the response to painful stimuli in nociceptors. In addition, we have investigated the expression and functional response of TRPA1 in mouse models of inflammatory pain because changes might modulate the excitability of pain sensing neurons after inflammation. Thus, we injected Complete Freund's Adjuvant (CFA) into the hind paw of mice. We assessed TRPA1 expression by means of calcium imaging of dissociated dorsal root ganglia (DRG) neurons and in situ hybridization of DRG sections after inflammation. The expression pattern of TRPA1 was unchanged when we compared untreated mice and inflamed animals. However, mustard oil evoked larger responses in CFA-treated mice compared to control mice. This suggests that TRPA1 might contribute to enhanced excitability and hypersensitivity during inflammation. Currently, we are generating transgenic mice with a point mutation in the EF-hand domain of TRPA1 and we will systematically analyze the phenotype of these mice with behavioral assays, patch clamping and skin-nerve preparations.

TRPA1 ist ein nicht-selektiver Ionenkanal der ‚Transient Receptor Potential‘ (TRP) Protein Familie. Dieser Kanal wird überwiegend in einem Teil von kleineren Schmerzfasern des peripheren Nervensystems exprimiert und kann durch diverse schmerzauslösende Substanzen aktiviert werden, wie zum Beispiel durch Akrolein und Senföl. Seine endogene Funktion ist noch immer ungeklärt, obwohl TRPA1 mittlerweile eine Rolle in der Schmerzbahn zugesprochen wird. Während meines PhD Projektes, habe ich die endogene Funktion von TRPA1 systematisch in vitro mit Hilfe von Kalzium Mikrofluorimetrie und der Patch-Clamp Technik untersucht. Erste Untersuchungen ergaben, dass TRPA1 ein leicht spannungssensitiver Kanal ist und direkt durch intrazelluläres Kalzium aktiviert wird. Interessanterweise wurde er durch mehrere Stimuli, die die intrazelluläre Kalziumkonzentration erhöhen, indirekt aktiviert. Mittels Mutagenese identifizierten wir eine EF-Hand Domäne im N-Terminus des Kanals, die für die Kalziumsensitivität des Kanals verantwortlich ist. Osmotischer Druck und warme Temperaturen öffneten den Kanal nicht, aber kalte Temperaturen aktivierte TRPA1 indirekt über einen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration. Wir schließen daraus, dass TRPA1 nicht der Kältesensor per se ist, aber die Antworten auf schmerzhafte Stimuli in Schmerzneuronen verstärkt. Des Weiteren, haben wir die Expression und funktionalen Antworten von TRPA1 in einem Entzündungsmodell für Mäuse untersucht, da Veränderungen zu einer gesteigerten Erregbarkeit der Schmerzneurone während einer Entzündung führen könnten. Aus diesem Grund wurde ‚Complete Freund’s Adjuvant‘ (CFA) in die Hinterpfote von Mäusen injiziert. Die Kanalexpression in Wurzelganglienzellen nach der Entzündung wurde mittels Kalzium Mikrofluorimetrie und in situ Hybridisierung geprüft. Das Expressionsmuster von TRPA1 blieb unverändert im Vergleich von gesunden und CFA-behandelten Tieren. Senföl führt aber zu einer erhöhten Zellantwort in CFA-behandelten Mäusen im Vergleich zu unbehandelten Mäusen. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass TRPA1 möglicherweise bei der erhöhten Erregbarkeit und Überempfindlichkeit während des Entzündungsprozesses eine Rolle spielt. Gegenwärtig, generieren wir transgene Mäuse mit einer Punktmutation in der EF- Hand Domäne von TRPA1 und werden den Phänotyp dieser Mäuse systematisch mit Verhaltensexperimenten, der Patch-Clamp Technik und Haut-Nerve Präparationen untersuchen.