Genetic Control of Pyramidal Neuron Differentiation and Survival by Neuronal bHLH Transcription Factors Neurod1, Neurod2 and Neurod6

Abstract

The neuronal bHLH transcription factors Neurod2 and Neurod6 are predominantly expressed in postmitotic pyramidal neurons of the developing neocortex and have previ- ously been shown to promote pyramidal neuron survival, differentiation, migration, and cortical connectivity. The closely related factor Neurod1 is normally only transiently expressed by intermediate precursor cells of the subventricular zone. In Neurod2/6 double-deficient mice, however, Neurod1-expression is ectopically maintained in post- mitotic pyramidal neurons of the cortical plate, thereby partially compensating for the loss of Neurod2/6. In conditional Neurod1/2/6 triple-deficient mice selectively lacking the ectopic up-regulation of Neurod1, neuronal survival, differentiation, migration, and connectivity are significantly stronger disturbed. I aimed to further understand the functions of NeuroD-family bHLH proteins in cortex development, with a mechanistic focus on the maintenance of pyramidal neuron survival and the establishment of different pyramidal neuron identities during earlier cortex development. In Neurod1/2/6-deficient mice, I identified an unprecedentedly strong wave of apop- totic cell death that was restricted temporarily to E14/15 and spatially to the dorso- medial cortex. Probably as a consequence, Sox5-positive pyramidal neurons of the neocortical layer 6 are lost, and the Tbr2-positive progenitor pool in the subventricular and intermediate zones is expanded. Remaining pyramidal neurons show immature molecular identities and mostly miss axonal connectivity at birth. Artificial expression of Neurod2 or Neurod6 in a subset of postmitotic pyramidal neurons was sufficient to overcome those structural defects, showing that the underlying mechanisms are of cell- intrinsic nature. Initially following a candidate-based approach, I investigated known inhibitors of apoptosis, neurotrophin signaling, and cell cycle control, but I could not identify a mechanism explaining the strong phenotype in Neurod1/2/6-deficient mice. To gain further mechanistic insight, I performed an unbiased comparable transcrip- tome analysis of the central neocortex at E13, just before the manifestation of obvious structural abnormalities in Neurod1/2/6-deficient mice. The most interesting finding was a nearly 4-fold up-regulation of Harakiri (Hrk), a small BH3-only pro-apoptotic protein of the Bcl2-family. In-situ hybridization confirmed robustly increased Hrk- expression at E13–E16. In-utero electroporation of Hrk into the developing cortex of wild-type mice was sufficient to kill cortical neurons. Electroporation of Hrk-shRNA into Neurod1/2/6-deficient mice prevented apoptosis of electroporated cells. As NeuroD-proteins are transcriptional activators, I postulated a transcriptional repressor downstream of Neurod1/2/6 to normally prevent Hrk-triggered apoptosis. The strongest down-regulated genes in Neurod1/2/6-deficient mice were Bhlhb5 and Prdm8, which are known to interact and form a repressors complex in cortical neurons. Electroporation of Bhlhb5 and Prdm8 into the cerebral cortex of Neurod1/2/6- deficient mice could rescue apoptosis, confirming their role in the control of cell death downstream of Neurod1/2/6.

Die neuronalen bHLH-Transkriptionsfaktoren Neurod2 und Neurod6 werden vor- wiegend in postmitotischen pyramidalen Neuronen des sich entwickelnden Neokortex exprimiert und haben bereits gezeigt, dass sie das Überleben, die Differenzierung, die Migration und die kortikale Konnektivität pyramidaler Neuronen fördern. Der eng ver- wandte Faktor Neurod1 wird normalerweise nur vorübergehend von intermediären Vor- läuferzellen in der subventrikulären Zone exprimiert. In Neurod2/6-doppeldeffizienten Mäusen wird die Neurod1-Expression jedoch ektopisch in postmitotischen Pyramiden- neuronen der kortikalen Platte aufrechterhalten, wodurch der Verlust von Neurod2/6 teilweise ausgeglichen wird. In konditionalen Neurod1/2/6-Dreifachmäusen, denen selektiv die ektopische Hochregulierung von Neurod1 fehlt, sind das neuronale Über- leben, die Differenzierung, die Migration und die Konnektivität deutlich stärker gestört. Mein Ziel war es, die Funktionen der bHLH-Proteine der NeuroD-Familie in der Kortex- entwicklung zu verstehen, wobei ich mich mechanistisch auf die Aufrechterhaltung des Überlebens von Pyramidenneuronen und die Etablierung verschiedener Identitäten von Pyramidenneuronen während der frühen Kortexentwicklung konzentrierte. Bei Neurod1/2/6-defizienten Mäusen konnte ich eine beispiellos starke Welle des apoptotischen Zelltods feststellen, die zeitlich auf E14/15 und räumlich auf den dorso- medialen Kortex beschränkt war. Wahrscheinlich als Folge davon gehen Sox5-positive Pyramidenneuronen der neokortikalen Schicht 6 verloren, und der Tbr2-positive Vorläuferpool in den subventrikulären und intermediären Zonen ist vermehrt. Die molekulare Identität der verbleibenden Pyramidenneuronen ist unreif und ihnen fehlt bei der Geburt meist die axonale Konnektivität. Die künstliche Expression von Neurod2 oder Neurod6 in einer Untergruppe postmitotischer Pyramidenneuronen reichte aus, um diese strukturellen Defekte zu beheben, was zeigt, dass die zugrunde liegenden Mechanismen zelleigener Natur sind. Zunächst untersuchte ich im Rahmen eines kandidatenbasierten Ansatzes bekannte Inhibitoren der Apoptose, der Neurotrophin- Signalübertragung und der Zellzykluskontrolle, konnte aber keinen Mechanismus identifizieren, der den starken Phänotyp in Neurod1/2/6-defizienten Mäusen erklärt. Um weitere Einblicke in die Mechanismen zu gewinnen, führte ich eine unvorein- genommene, vergleichbare Transkriptomanalyse des zentralen Neokortex bei E13 durch, also kurz vor dem Auftreten offensichtlicher struktureller Anomalien bei Neurod1/2/6-defizienten Mäusen. Der interessanteste Befund war eine fast 4-fache Hochregulierung von Harakiri (Hrk), einem kleinen, nur BH3 enthaltenden pro- apoptotischen Protein der Bcl2-Familie. Die In-situ-Hybridisierung bestätigte eine stark erhöhte Hrk-Expression bei E13-E16. Die inutero-Elektroporation von Hrk in den sich entwickelnden Kortex von Wildtyp-Mäusen war ausreichend, um kortikale Neuronen abzutöten. Die Elektroporation von Hrk-shRNA in Neurod1/2/6-defizienten Mäusen verhinderte die Apoptose der elektroporierten Zellen. Da NeuroD-Proteine Transkriptionsaktivatoren sind, postulierte ich einen Tran- skriptionsrepressor stromabwärts von Neurod1/2/6, der normalerweise die durch Hrk ausgelöste Apoptose verhindert. Die am stärksten herunterregulierten Gene in Neurod1/2/6-defizienten Mäusen waren Bhlhb5 und Prdm8, von denen bekannt ist, dass sie interagieren und einen Repressor-Komplex in kortikalen Neuronen bilden. Die Elektroporation von Bhlhb5 und Prdm8 in die Großhirnrinde von Neurod1/2/6- defizienten Mäusen konnte die Apoptose retten, was ihre Rolle bei der Kontrolle des Zelltods stromabwärts von Neurod1/2/6 bestätigt.