Die Rolle des Hedgehog-Signalwegs in der Leberregeneration in einem Mausmodell der Nichtalkoholischen Steatohepatitis (NASH)

Abstract

Leptindefiziente Ob/ob-Mäuse entwickeln spontan eine Fettleber und Steatohepatitis und sind damit ein Modell für NASH. 1\. Durch Kombination von gesunden Wildtyp- und chronisch geschädigten Ob/ob-Mäusen mit dem Hepatotoxin und Ovalzell-Induktor Ethionin wurde ein Modell progredienter Leberschädigung entwickelt mit den Stufen einer gesunden Leber, chronischer Inflammation, akuter Schädigung mit Ethionin im Wildtyp und akut-auf-chronischer Leberschädigung mit Ethionin in den Ob/ob-Mäusen. Serummarker wie ALT, AST und AP belegen dies (Tab. 3). 2\. Mittels Immunhistochemie und Färbung der bekannten Progenitorzellmarker CK-19, NCAM und A6 wurde nachgewiesen, dass im Vergleich zur Wildtyp-Maus in der Ob/ob-Maus als Modell der milden Steatohepatitis der Progenitorzellpool bereits expandiert ist (Abb. 6). 3\. Der Hedgehog-Signalweg spielt eine Rolle in der Leberentwicklung und konnte im hepatozellulären Karzinom und im Hepatoblastom hochaktiv nachgewiesen werden. Da Tumore häufig auf dem Boden chronischer Inflammation und damit chronischer Regeneration entstehen, wurde im hier etablierten Modell die Aktivität des Hedgehog-Signalwegs untersucht. Dabei konnte mithilfe der Immunhistochemie in den Ob/ob-Mäusen mit NASH eine Aktivierung des Hedgehog-Signalwegs nachgewiesen werden: sowohl Ihh als Ligand als auch der Transkriptionsfaktor Gli-2 als Effektormolekül waren deutlich hochreguliert (Abb. 7, Abb. 12). Interessanterweise zeigte sich bereits in Wildtyp- und Ob/ob-Mäusen ohne Toxinbehandlung eine unterschiedliche räumliche Verteilung der hedgehog- aktiven Zellen im Lebergewebe (Abb. 8). 4\. Wird auf diesen chronischen Entzündungszustand der NASH ein zusätzlicher akuter, toxischer Schaden durch die Gabe von Ethionin erzeugt, kommt es zur Apoptose adulter Hepatozyten (Abb. 9) und zur Expansion sowie Veränderung des Progenitorzellpools (Abb. 10). Die Expansion ist bereits in der H&E-F;ärbung deutlich, die Färbungen für CK-19, NCAM und A6 zeigen nach Ethionin deutliche Unterschiede zum Kontrollbefund. NCAM scheint kein spezifischer Marker für Progenitorzellen zu sein, sondern er scheint sich im Rahmen der Aktivierung der Zellen zu verändern. 5\. Die vorgeschädigte Leber der Ob/ob-Maus reagiert besonders sensibel auf Ethionin (Abb. 9) und zeigt eine vermehrte Fibroseantwort (Abb. 13). Dieser Befund steht im Widerspruch zu Berichten anderer Arbeitsgruppen, die Ob/ob-Maus würde aufgrund der Leptindefizienz und damit reduzierter Antwort myofibroblastischer Sternzellen keine Fibrose entwickeln [118]. Die hier vorgestellten Daten zeigen jedoch zweifelsfrei eine deutliche Erhöhung der Sirius-Red-positiv gefärbten Bindegewebsfasern, eine 2,8-fache Erhöhung des Hydroxyprolins sowie eine deutlich gesteigerte Expression der mRNA für Collagen Iα1, TGFß und αsma in der ethioningeschädigten Ob/ob-Leber. Möglicherweise liegt dies an der hier stärkeren Schädigung, die entweder die myofibroblastischen Sternzellen trotz Leptindefizienz aktiviert oder zusätzliche Zellen, z.B. Hepatozyten, zur Produktion von Matrixproduktion stimuliert. 6\. Die Aktivierung des Hedgehog-Signalwegs durch den zusätzlichen Ethioninschaden konnte sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene nachgewiesen werden: sowohl die Translation der Hedgehogsignalweg-rezeptoren PTCH-1 und SMO sowie der Transkriptionsfaktoren Gli-1, Gli-2 und Gli-3 (Abb.10) wurde dosisabhängig mit zunehmender Schwere des Leberschadens gesteigert. In der Immunhistochemie verdoppelt sich der Anteil Ihh-exprimierender Zellen nach Ethioninbehandlung sowohl in den Wildtyp-, als auch in den Ob/ob-Mäusen. Nach Ethioninbehandlung sind in den Ob/ob-Mäusen viele Hepatozyten im Kern positiv für Gli-2. Die Frage, ob das für junge, noch nicht ausgereifte, regenerierte Hepatozyten spricht oder für eine Umdifferenzierung bzw. Reaktivierung embryonaler Signalwege aufgrund des Stress durch die Toxizität kann mit der gegenwärtigen experimentellen Anordnung nicht beantwortet werden. Damit konnte gezeigt werden, dass der Hedgehog-Signalweg in einem Modell der nichtalkoholischen Steatohepatitis aktiv ist und seine Aktivität mit zunehmender Schädigung und Expansion des Progenitorzellpools ansteigt. Zur weiteren Analyse dieses Regenerationsmechanismus müsste untersucht werden, wie er durch eine Hemmung des Hegdehog-Signalwegs verändert wird und ob unter diesen Bedingungen weiterhin Fibrose induziert wird. Möglicherweise ist der Hedgehog-Signalweg ein Kandidat für die therapeutische Manipulation und Verhinderung unerwünschter Regenerationsergebnisse wie Fibrose oder Karzinomentwicklung. Auch das Ausmaß der Regenerationsantwort könnte so beeinflusst werden.

Leptin-deficient ob/ob-mice spontaneously develop fatty liver and steatohepatitis; they are therefore a model for Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH). 1\. By combining healthy wildtype mice and ob/ob-mice with mild chronic liver injury with the hepatotoxin and oval-cell inductor ethionine, a model of progressive liver injury was developed (healthy liver, chronic fatty liver and inflammation, acute injury (wildtype mouse + ethionine) and acute- on-chronic injury (ob/ob-mouse + ethionine)). This is reflected in the serum markers ALT, AST and AP. 2\. Immunohistochemistry for the progenitor cell markers CK-19, NCAM and A6 shows that the progenitor pool is already expanded in Ob/ob-mice with NASH compared to wildtype mice. 3\. Hedgehog signaling plays a role in liver development and has been demonstrated in hepatocellular carcinoma and in hepatoblastoma. As tumors tend to develop in tissues with chronic inflammation and regeneration, hedgehog activity was analyzed in the established model. Immunohistochemistry showed an activation of hedgehog signaling in ob/ob-mice with NASH: Indian Hedgehog as a ligand and transcription factor Gli-2 were upregulated. Interestingly, a different distribution of hedgehog-active cells within the liver tissue was noted already in wildtype and ob/ob-mice without ethionine treatment 4\. The acute hepatocyte injury by ethionine leads to apoptosis of adult hepatocytes in ob /ob-mice with chronic NASH as well as to expansion of and changes in the pool of progenitor cells. The expansion of progenitor cells is already obvious in H&E-staining;, immunohistochemistry for CK-19 NCAM and A6 show significant differences to wildtype control. NCAM seems to be not a specific marker for progenitor cells, but its expression seems to change with activation of the cells. 5\. The chronically damaged liver of the ob/ob-mouse reacts to ethionine in a very sensitive way and shows more fibrosis. This finding is contrarily to reports of other groups claiming that the ob/ob mouse does not develop fibrosis because less myofibroblastic stellate cells due to leptin deficiency [118]. The data presented here show a significant increase in sirius red positive collagen fibers, a 2.8x increase in hydroxyproline as well as significantly increased mRNA-expression for collagen Iα1, TGFß and αsma in the ob/ob.liver with acute ethionine injury. Maybe the stronger damage here induces either more stellate cell activity in spite of the lack of leptin or stimulates other cells, e.g. hepatocytes, to produce extracellular matrix. 6\. Activation of hedgehog-Signaling by ethionine damage was shown on mRNA- and protein level. On mRNA-Level, expression of hedgehog receptors PTCH-1 and SMO as well as of transcription factors Gli-1, Gli-2 and Gli-3 was increased in a dose-response-relationship. In Immunohistochemistry, the amount of ihh- positive cells was doubled after ethionine treatment in wildtype as well as ob /ob-mice. After ethionine treatment, many hepatocyte nuclei are positive for gli-2 in immunohistochemistry. If these cells are undifferentiated new hepatocytes or de-differentiated adult hepatocytes cannot be answered with the present experimental design. Hedgehog signaling was shown to be active in a model of nonalcoholic steatohepatitis and its activity increases with increasing expansion of the progenitor cell pool. To further understand this mechanism of regeneration, hedgehog signaling should be inhibited and progenitor response as well as fibrosis should be analyzed. Hedgehog Signaling may be a candidate for therapeutic manipulation and prevention of fibrosis and carcinoma.