Identification and Analysis of the Heparan Sulfate-Binding Domain and Cellular Factors Involved in the Entry of Human Endogenous Retrovirus K HERV-K (HML-2)

Abstract

The human endogenous retroviruses (HERVs) are remnant elements of ancient retroviruses that infected the human ancestors' germline and integrated into their genome, and thereby passed down to their descendants in a mendelian fashion. The HERV-K (HML-2) family includes the most intact and complete sequences of human-specific elements with conserved ORF for most of their proteins and the ability to produce viral particles. The viral envelope protein (Env) promoted the initial endogenization activities and was shown to have a broad tropism. It mediates the viral entry through interaction with the cell surface heparan sulfates (HS). In this study, we demonstrated first that the specified receptor binding site (RBS) of HML-2 Env is not involved in binding HS. Further, to identify the involved domain in binding HS, we aligned the protein sequence of HML-2 Env to that of the mouse mammary tumor virus (MMTV). This way, we identified an HS-binding domain (HBD) at the N-terminus of the HML-2 Env between residues 216 and 236, corresponding to MMTV HBD. Generated mutations in all positively charged residues of this domain impaired binding to heparin-coated beads and blocked viral entry. Moreover, mutations in the residues R216, K219, and K223, were influential in HS binding and the viral entry. In the second and third parts of the study, we aimed to identify the cellular factors or requirements for HML-2 Env in its early entry pathway utilizing two approaches. In the first approach, we successfully generated a trimer fusion protein for HML-2 consisting of the SU subunit fused with fibritin, a trimerization domain derived from the bacteriophage T4. The trimer fusion protein bound HS similarly to the native Env. However, it did not block HML-2 Env viral entry. Using this trimer fusion protein, we specifically co-purified the Golgi membrane protein 73 (GP73) as a potential attachment factor for HML-2 Env. The second approach included using HML-2 Env pseudotyped viral particles in conducting a functional screening of a cDNA library for transmembrane proteins in a non-permissive cell line. Screening results identified six transmembrane proteins (TMEM9, C12ORF59, IL1RAP, PSCA, LETMD1, and MPEG1) involved in the entry pathway of HML-2 that confer the susceptibility to it. We also found that only IL1RAP and MPEG1 proteins confer susceptibility in a different non-permissive cell line. Our results affirmed the role of HS in the HML-2 Env attachments and identified the specific HBD involved. They also affirmed the contribution of another molecule(s) that serves as the receptor(s). In those lines seven transmembrane proteins involved in the entry pathway of HML-2 Env were identified.

Die Humanen Endogenen Retroviren (HERVs) sind Restbestandteile alter Retroviren, die die Keimbahn der menschlichen Vorfahren infizierten und in ihr Genom integriert wurden. Sie werden seither nach den Mendelschen Regeln an ihre Nachkommen weitergegeben. Die HERV-K (HML-2)-Familie umfasst die intaktesten und vollständigsten Sequenzen mit konservierten Leserahmen für die meisten ihrer Proteine und die Fähigkeit, virale Partikel zu produzieren. Das virale Hüllprotein (Env) förderte die anfängliche Endogenisierung und zeigt einen breiten Tropismus. Es vermittelt die Infektion durch erste Wechselwirkung mit Heparansulfaten (HS) auf der Zelloberfläche. In dieser Studie zeigten wir, dass die Rezeptorbindungsstelle (RBS) von HML-2 Env nicht an der Bindung von HS beteiligt ist. Um die daran beteiligte Domäne zu identifizieren, haben wir die Proteinsequenz von HML-2 Env mit der des Maus-Mammatumorvirus (MMTV) verglichen. Am N-Terminus des HML-2 Env wurde so eine potentielle homologe HS-bindende Domäne (HBD) zwischen den Positionen 216 und 236 identifiziert. Mutationen in allen positiv geladenen Resten dieser Domäne beeinträchtigten die Bindung an Heparin-beschichtete Beads und blockierten die Infektion. Darüber hinaus waren Mutationen an den Positionen R216, K219 und K223 für die HS-Bindung und den viralen Zelleintritt maßgeblich. Im zweiten und dritten Teil der Studie wollten wir die zellulären Faktoren für den HML-2 Env vermittelten Zelleintritt mit zwei Ansätzen identifizieren. Im ersten Ansatz ist es gelungen, ein Trimer-Fusionsprotein für HML-2 zu erzeugen, das aus der SU-Untereinheit besteht, die mit der Trimerisierungs-domäne fusioniert ist. Sie ist vom Fibritin des Bakteriophagen T4 abgeleitet. Das Trimer-Fusionsprotein bindet HS ähnlich wie das native Env. Es blockierte jedoch nicht den Eintritt von HML-2 in die Zellen. Mit diesem Fusionsprotein wurde das Golgi-Membranprotein 37 (GP73) als potenzieller Bindungsfaktor für HML-2 Env gefunden. Der zweite Ansatz umfasste die Verwendung von HML-2 Env-Pseudoviren bei der Durchführung eines funktionellen Screenings einer cDNA-Bibliothek mit einer nicht-permissiven Zelllinie. Damit wurden 6 Transmembranproteine (TMEM9, C12ORF59, IL1RAP, PSCA, LETMD1 und MPEG1) identifiziert, die am Infektionsprozess von HML-2 beteiligt sind. Nur IL1RAP und MPEG1 konnten allerding den Eintritt in eine andere nicht-permissiven Zelllinie vermitteln. Die Arbeiten bestätigen die Rolle von HS bei der Zelladhärenz von HML-2 Env und identifizierten die spezifische HBD. Sie bestätigten auch die Beteiligung eines oder mehrerer anderer Moleküle, die als Rezeptor(en) dienen. In diesem Zusammenhang wurden 7 Transmembranproteine identifiziert, die am Eintrittsweg von HML-2 beteiligt sind.