Biomarkers in equine synovial fluid and serum for the diagnosis of joint diseases

Abstract

Joint disease has a major impact on the athletic performance in horses, thus representing not only a welfare issue but also a source of economic loss due to veterinary expenses, limited performance, and early retirements. Its diagnosis is routinely established on the basis of clinical lameness examination, radiography, and conventional synovial fluid analysis. Accurate assessment of joint disease is essential to determine adequate treatment and prognosis. However, definite diagnosis often remains difficult. Biomarkers in body fluids could offer clinicians a valuable tool to identify advanced stages of joint diseases more accurately. Various marker molecules have already been used successfully in research settings, but to date none has been introduced and validated in everyday horse practice. The aim of this study was to evaluate the possible use of selective parameters, namely MPO activity and MPO concentration, MMP-2 and -9 activities, C2C, CTXII, CPII, and CS846 concentrations, in equine synovial fluid and serum as diagnostic markers of joint diseases. Equine samples were taken from horses affected with septic arthritis, osteoarthritis (OA), chronic arthritis, osteochondrosis dissecans (OCD), and from healthy controls. For the determination of MPO activity a specifically modified MPO assay was established in this study. The results show this assay to be a reliable and feasible tool for a specific detection of MPO activity in equine synovial fluid and serum. Furthermore, MPO concentration in synovial fluid was determined using an equine MPO immunoassay. MPO activity and MPO concentration were significantly increased in synovial fluids from septic arthritis compared to all other diagnostic groups. Using gelatin zymography, this study demonstrates that MMP-2 and -9 activities increase considerably under pathological conditions. For a precise quantification of enzyme activities, MMP-2 and -9 immunocapture activity assays were introduced. MMP-2 and -9 activities were significantly elevated in synovial fluids from septic arthritis compared to all other diagnostic groups, and MMP-2 activity was significantly increased in synovial fluids from OA and chronic arthritis compared to controls and OCD samples. For the evaluation of markers of cartilage metabolism, C2C, CTXII, CPII, and CS846 immunoassays were applied on equine samples. CTXII concentration was significantly increased in synovial fluids from septic arthritis compared to all other diagnostic groups and in synovial fluids from OA and chronic arthritis compared to controls. Serum CTXII levels were significantly elevated in septic arthritis specimens compared to controls. No significant differences for C2C concentrations could be detected between any of the diagnostic groups. CPII and CS846 concentrations were significantly decreased in synovial fluids from OA and chronic arthritis compared to all other diagnostic groups. Serum CS846 concentration was significantly increased in septic arthritis specimens compared to all other diagnostic groups, and serum CPII concentration was significantly elevated in septic arthritis specimens relative to the chronic arthritis group. Equine samples were further classified into predefined diagnostic groups based on certain parameter(s) using discriminant analysis. Serum parameters investigated in this study showed correct classification rates below 50% indicating that they are of less clinical value to indicate joint disease. Synovial CTXII concentration showed the greatest correct classification rate of 68.4% for a single parameter. A combination of biomarkers seems to be most promising for an accurate assessment of joint condition. The highest overall correct classification rate of 86.7% was found for a three-combination system of synovial CTXII, CS846, and CPII concentrations. It appears that synovial markers of cartilage metabolism, particularly CTXII, CS846, and CPII concentrations may have the greatest potential to discriminate between different joint diseases. These observations provide new insights into the diagnostic potential of diverse biomarkers in equine joint diseases. The results presented here may help to refine the diagnosis of distinct joint diseases and provide a profound basis for further studies on biomarkers for equine joint disease.

Gelenkerkrankungen haben einen erheblichen Einfluss auf die sportliche Leistung von Pferden und verursachen zudem hohe wirtschaftliche Verluste durch tierärztliche Aufwendungen. Ihre Diagnose wird routinemäßig auf Grundlage der klinischen Lahmheitsuntersuchung, Röntgenbildauswertung und konventionellen Synoviaanalyse gestellt. Eine präzise Diagnose kann sich oft schwierig gestalten, ist jedoch für eine optimale Behandlung und Prognose von entscheidender Bedeutung. Die Analyse von Biomarkern in Körperflüssigkeiten kann dem Kliniker wertvolle Hinweise liefern, um Gelenkerkankungen präziser zu diagnostizieren. Verschiedene Markermoleküle wurden in der Forschung bereits erfolgreich getestet, jedoch bis zum heutigen Tag in der tierärztlichen Praxis noch nicht eingeführt und validiert. Das Ziel dieser vorliegenden Arbeit war die Untersuchung selektiver Parameter, wie die der MPO-Aktivität und -Konzentration, der MMP-2 und -9-Aktivitäten, der C2C-, CTXII-, CPII- und CS846-Konzentrationen auf ihren potentiellen Einsatz als diagnostische Marker bei Gelenkerkrankungen des Pferdes. Die Proben wurden von an septischer Arthritis, Osteoarthritis (OA), chronischer Arthritis, und Osteochondrosis dissecans (OCD) erkrankten Pferden sowie von gesunden Kontrolltieren genommen. Für die Bestimmung der MPO-Aktivität wurde ein speziell modifizierter MPO- Assay etabliert und validiert. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser für die spezifische Messung der MPO-Aktivität in der Synovia und im Serum von Pferden eine zuverlässige und praktikable Methode darstellt. Darüber hinaus wurde die MPO-Konzentration in der Synovia mit einem equinen MPO-Immunoassay ermittelt. Die MPO-Aktivität und MPO Konzentration waren in Gelenken mit septischer Arthritis im Vergleich zu Gelenken aller anderen diagnostischen Gruppen signifikant erhöht. Mit Hilfe der Gelatine-Zymography wurden in den erkrankten Gelenken erhöhte MMP-2 und -9-Aktivitäten nachgewiesen. Für die genauere Quantifizierung wurden Aktivitäts-Immuno-Assays verwendet. Signifikant erhöhte MMP-2 und -9-Aktivitäten wurden in der Synovia von Gelenken mit septischer Arthritis im Vergleich zu allen anderen diagnostischen Gruppen nachgewiesen. Zudem war die MMP-2-Aktivität in der Synovia von Gelenken mit OA und chronischer Arthritis signifikant höher, als die der Kontrollgruppe und der OCD-Proben. Marker des Knorpelstoffwechsels wurden mittels C2C-, CTXII-, CPII-, und CS846- Immunoassays bestimmt. Die CTXII-Konzentration war bei septischer Arthritis im Vergleich zu allen anderen diagnostischen Gruppen signifikant erhöht. Erhöhte CTXII-Konzentrationen wiesen auch Gelenke von Pferden mit OA und chronischer Arthritis im Vergleich zu Kontrolltieren auf. Bezüglich der Serum CTXII- Konzentrationen waren die Werte bei septischer Arthritis signifikant höher verglichen zu den Kontrollen. Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den diagnostischen Gruppen bezüglich der C2C-Konzentrationen festgestellt werden. CPII- und CS846-Konzentrationen waren signifikant niedriger in Gelenken mit OA und chronischer Arthritis im Vergleich zu allen anderen diagnostischen Gruppen. Die Serum CS846-Konzentration war signifikant erhöht in Pferden mit septischer Arthritis im Vergleich zu allen anderen diagnostischen Gruppen. Ebenso konnte für die Serum CPII-Konzentration eine signifikante Erhöhung in Pferden mit septischer Arthritis, verglichen zu Pferden mit chronischer Arthritis, gezeigt werden. Mit Hilfe der Diskriminanzanalyse auf der Basis der ermittelten Parameter, wurden die Proben in die klinisch vordefinierten diagnostischen Gruppen klassifiziert. Der Prozentsatz der korrekt klassifizierten Proben lag für die untersuchten Serum-Parameter unter 50%, was auf ein relativ geringes diagnostisches Potential schließen lässt. Die CTXII-Konzentration in der Synovia zeigte den größten Prozentsatz korrekt klassifizierter Proben (68,4%). Darüber hinaus scheint für eine präzise Diagnose der Gelenkerkrankung eine Kombination von Biomarkern am vielversprechendsten. Die höchste Gesamtrate korrekt klassifizierter Proben von 86,7% wurde für die Parameter-Kombination CTXII-, CS846- und CPII-Konzentrationen in der Synovia ermittelt. Aus diesen Ergebnissen lässt sich schließen, dass die Marker des Knorpelstoffwechsels, insbesondere die CTXII, CS846 und CPII-Konzentrationen eine bestmögliche Differenzierung zwischen Gelenkerkrankungen erlauben. Die vorliegenden Untersuchungen liefern neue Erkenntnisse hinsichtlich des diagnostischen Potentials ausgewählter Biomarker für Gelenkerkrankungen des Pferdes. Die hier vorgestellten Ergebnisse können die Diagnostik von Gelenkerkrankungen verbessern und bilden zudem eine solide Ausgangsbasis für weitere Studien.