Identification and characterisation of Chlamydia psittaci Inc proteins and mechanistic elucidation of doxycycline-induced persistence of Chlamydia trachomatis

Abstract

The obligate intracellular pathogens Chlamydia trachomatis and C. psittaci can infect humans, while C. psittaci also infect birds. During the intracellular infection, the bacteria replicate and develop inside of a membrane component, called inclusion. Chlamydia secrete proteins into the inclusion membrane, so called inclusion membrane proteins (Inc proteins). Inc proteins modify the inclusion and interact with host cell proteins. Dependent on species and even serovar, they cause different diseases with consequential damage if treatment fails. Patients infected with C. trachomatis serovar D are treated with the translation inhibitor doxycycline. Doxycycline induces a state in C. trachomatis serovar D, called persistence, which enables to persist the treatment and continue infection afterwards. This work identifies and characterises C. psittaci Inc proteins, and elucidates the mechanism of doxycycline-induced persistence of C. trachomatis serovar D. C. psittaci, as a zoonotic pathogen of birds and humans, was investigated according to host cellular interaction to decipher interspecies similarities and basics to understand the pathogens' capability to adapt to different hosts. A new method was established to study the interactions between Inc proteins and the host cell: split-Inc proteins. The split-Inc proteins are based on the enhanced green fluorescent protein eGFP, which replaces the membrane domain of Inc proteins. The integration of the N- and C-terminal cytosolic domains of an Inc protein enables mimicry of native interactions. The eGFP portion of split-Inc proteins allows the co-immunoprecipitation of protein interaction complexes and subsequent identification of single interaction partners by mass spectrometry. In silico analyses identified 11 putative Inc proteins of C. psittaci, of which 8 were further characterised. The transcriptional quantification of their gene expression enabled categorisation according to the phase of chlamydial development during the infection. Using split-Inc proteins, human interaction partners were identified for the Inc proteins CP0355, CP0856, CP0857, CP0558 and CP0598. These human interaction partners are associated with host cell expression, cytokinesis, cytoskeletal rearrangements, fatty acid metabolism and amino acid supply. The Inc proteins CP0534, CP0535 and CP0181 were suggested to participate in inclusion stability and organisation of Inc proteins in so-called microdomains in the inclusion. Investigation of doxycycline-induced persistence of C. trachomatis serovar D showed translational activity despite doxycycline treatment. It was assumed that trans-translation enables the active translation. The trans-translation, known from Escherichia coli, is a mechanism that dissociated a stalled translation complex. Transcriptional quantification showed that C. trachomatis serovar D transcribes components of the trans-translation mechanism, indicating that trans-translation supports the persistence. Subsequently, differences in the chlamydial proteome and inclusion-recruited host cell proteins were analysed during doxycycline treatment. The isolation of intact inclusions allowed to perform so-called label-free proteomics. The resulting proteins were identified by mass spectrometry and showed significant abundant IncD and Ras-related GTPase Rab12. Follow-up investigations demonstrated that the Inc protein IncD recruits the ceramide transport protein CERT during the persistence, underscoring a role in inclusion stability by enriched ceramides. The knockdown of Rab12 displayed an enhanced recovery of C. trachomatis serovar D after doxycycline treatment and a reduced progeny formation during the acute infection. Rab12 is involved in autophagy and iron homeostasis. This let suggest that Rab12-recruitment in acute infection supports chlamydial iron uptake and impedes autophagy of the inclusion during persistence. Using the results of the proteomes, Furthermore, differences in chlamydial protein regulation was analysed to determine changes in metabolic pathways using the proteome data. During persistence, enzymes of the tricarboxylic acid cycle were slightly increased as well as ABC transporter. Enzymes according to peptidoglycan synthesis and translation were reduced, while MreB, part of the divisome and cell division, was abundant in persistence. Based on the results and available publications, chlamydial persistence was elucidated. Therefore, chlamydial persistence is the consequence of stalled cell division. Any stimulus can induce persistence, if time of infection, treatment timing and stimulus concentration allow a basal chlamydial activity. In addition, the survival of C. trachomatis serovar D during the persistence depends on the stability of bacterial membrane and inclusion. In sum, new C. psittaci Inc proteins were identified and characterised. The determination of human host cell interaction partners provides new starting points to investigate C. psittaci. The newly established split-Inc protein method enables the mimicry of native interactions and serves a better opportunity to investigate interactions with Inc proteins, supporting future investigations. Finally, the doxycycline-induced persistence of C. trachomatis serovar D was elucidated and further factors were identified that help understanding the chlamydial development. The determination of translational activity during the doxycycline-induced persistence opens new starting points for interesting follow-up investigations.

Die obligat intrazellulären Pathogene Chlamydia trachomatis und C. psittaci können Menschen infizieren, wohingegen C. psittaci auch Vögel infiziert. Während der intrazellulären Infektion replizieren und entwickeln sich die Bakterien in einer Einschlussmembran, die sogenannte Inklusion. Chlamydia sekretieren Proteine in die Inklusionsmembran, sogenannte Inklusionsmembranproteine, kurz Inc Proteine. Mit Hilfe dieser Proteine modifizieren Sie die Inklusionsmembran und interagieren mit Wirtszellproteinen. Je nach Spezies und Serovar können sie bestimmte Krankheiten verursachen und zu Folgeschäden führen, sollte die Behandlung fehlschlagen. Patienten, die mit C. trachomatis serovar D infiziert sind, werden mit dem Translationsinhibitor Doxycyclin behandelt. Doxycyclin induziert bei C. trachomatis serovar D einen Zustand, genannt Persistenz, der es ihnen ermöglicht, die Behandlung zu überstehen und anschließend die Infektion fortzufahren. Diese Arbeit identifiziert und charakterisiert C. psittaci Inc Proteine, und klärt den Mechanismus der Doxycyclin-induzierten Persistenz von C. trachomatis serovar D auf. C. psittaci, als zoonotischer Erreger von Vögeln und Menschen, wurde auf Wirtszellinteraktionen untersucht, um Spezies-übergreifende Ähnlichkeiten zu entschlüsseln und um die Grundlage der Fähigkeit, sich an verschiedene Wirte anzupassen, besser zu verstehen. Zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Inc Proteinen und der Wirtszelle wurde eine neue Methode etabliert: Split-Inc Proteine. Die Split-Inc Proteine bauen auf das grün fluoreszierende Protein eGFP, welches die Membrandomäne der Inc Proteine ersetzt. Die Integration der N- und C-terminalen cytosolischen Domänen des Inc Proteins ermöglicht es, native Interaktionen zu imitieren. Mit Hilfe des eGFPs der Split-Inc Proteine können Proteininteraktionskomplexe co-immunopräzipitiert und einzelne Interaktionspartner in der Massenspektrometrie identifiziert werden. In silico-Untersuchungen identifizierten 11 mögliche Inc Proteine in C. psittaci, wovon 8 weiter charakterisiert wurden. Die transkriptionelle Quantifizierung ihrer Genexpression ermöglichte die Zuordnung zu bestimmten Phasen der chlamydialen Entwicklung während der Infektion. Unter Verwendung der Split-Inc Proteine wurden für die Inc Proteine CP0355, CP0856, CP0857, CP0558 und CP0598 humane Interaktionspartner identifiziert, die mit der Wirtszellexpression, Cytokinese, Organisation des Cytoskeletts der Wirtszelle, Fettsäuremetabolismus und Aminosäureversorgung zusammenhängen. Für die Inc Proteine CP0534, CP0535 und CP0181 wurde eine Beteiligung an der Stabilität der Inklusion und Organisation von Inc Proteinen in sogenannten Mikrodomänen in der Inklusion vorhergesagt. Die Untersuchung der Doxycyclin-induzierten Persistenz von C. trachomatis serovar D ergab, dass das Pathogen trotz Behandlung mit Doxycyclin translational aktiv ist. Es wurde vermutet, dass die aktive Translation durch die Trans-translation ermöglicht wird. Die Trans-translation, bekannt aus Escherichia coli, ist ein Mechanismus, der die Dissoziation eines ins Stocken geratenen Translationskomlpex bewirkt. Transkriptionelle Quantifizierung ergab, dass C. trachomatis serovar D Komponenten des Mechanismus transkribiert, weshalb angenommen wird, dass die Trans-translation zur Persistenz beiträgt. Anschließend wurden Änderungen des chlamydialen Proteoms und der Inklusionsrekrutierten Wirtszellproteine während der Doxycyclin-Behandlung untersucht. Sogenannte markierungsfreie Proteomics wurden durch die Isolierung intakter Inklusionen ermöglicht. Die resultierenden Proteine wurden per Massenspektrometrie identifiziert und ergaben signifikante Anreicherung vom Inc Protein IncD und der Ras-related GTPase Rab12. Folgeuntersuchungen ergaben, dass IncD das Ceramid-Transportprotein CERT während der Persistenz zur Inklusion rekrutiert, was eine Bedeutung der Inklusionsstabilität durch angereicherte Ceramide hervorhebt. Der Knock-down von Rab12 ergab eine verbesserte Erholung von C. trachomatis serovar D nach der Doxycyclin-Behandlung, reduzierte allerdings die Nachkommenbildung während der akuten Infektion. Rab12 ist an der Autophagie und der Eisenhomöostase beteiligt. Dies ließ vermuten, dass die Rab12-Rekrutierung in der akuten Infektion die chlamydiale Eisenaufnahme unterstützt und während der Persistenz die Autophagie der Inklusion verhindert. Weiterhin wurde mit Hilfe der Proteome die chlamydiale Proteinregulation analysiert, um Veränderungen bestimmter Stoffwechselwege zu ermitteln. Während der Persistenz sind Enzyme des Citratzyklus leicht erhöht, sowie einige ABC-Transporter. Enzyme der Peptidoglykansynthese und Translation waren reduziert, während MreB, Teil des Divisoms und der Zellteilung, in der Persistenz erhöht vorkam. Anhand der Ergebnisse und vorhandener Publikationen konnte die chlamydiale Persistenz aufgeklärt werden. Somit ist chlamydiale Persistenz die Folge von angehaltener Zellteilung. Jeder Stimulus kann zur Persistenz führen, wenn der Zeitpunkt der Infektion und Behandlungsbeginn, und die Konzentration des Stimulus eine basale chlamydiale Aktivität ermöglichen. Zudem ist das Überleben von C. trachomatis serovar D während der Persistenz von der Stabilität der bakteriellen Membran und Inklusion abhängig. Zusammenfassend konnten neue C. psittaci Inc Proteine identifiziert und charakterisiert werden. Die Ermittlung der humanen Wirtszellinteraktionspartner liefert neue und weitere Ansatzpunkte zur Untersuchung von C. psittaci. Die neu-etablierte Split-Inc Protein Methode ermöglicht die Imitation nativer Interaktionen und bietet somit eine verbesserte Möglichkeit zur Untersuchung von Interaktionen von Inc Proteinen, die bei zukünftigen Fragestellungen Anwendung finden kann. Zudem wurde die Doxycyclin-induzierte Persistenz von C. trachomatis serovar D aufgeklärt und weitere Faktoren identifiziert, die zur chlamydialen Entwicklung beitragen. Die Ermittlung aktiver Translation während der Doxycyclin-induzierten Persistenz bietet Ansätze für interessante Folgeuntersuchungen.