Prognostic Implications of Cellular Senescence in Acute Myeloid Leukemia

Abstract

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous disease for which biologically grounded predictors of outcome remain a clinical need. In addition to tumor cell death, antineoplastic drugs can mediate a long-lasting growth arrest of vital, metabolically active tumor cells termed therapy-induced senescence, but structured investigations into its prognostic and predictive power are lacking. Besides its occurrence in response to chemotherapeutic treatment, cellular senescence can be evoked by replicative stress or activation of oncogenes and serves as an initial barrier to cancer development. Yet, long-term effects of senescent cancer cells on tumor growth are unclear as they are known to mediate inflammation via a senescence-associated secretory phenotype (SASP) and are subjected to epigenetic remodeling, thereby acquiring cancer stemness characteristics. In an ex vivo analysis of AML blast samples from patients at diagnosis, I aimed to characterize basal as well as treatment-evoked senescence and determine its role as a prognostic and predictive biomarker. I established assays to detect and therapeutically induce senescence in a primary AML culture setting. Senescence was assessed by senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal) activity and other senescence markers. Gene expression analyses validated my experimental characterization of AML samples as “senescent”, as evidenced by upregulation of senescence-associated gene expression signatures. For prognostic analysis, clinical outcomes and molecular genetics of AML sample donors were retrieved. I found the intra-individual changes of senescence levels in response to the standard anti-leukemic agent daunorubicin to be positively correlated with better disease-free- and overall patient survival. In line with this, a more favorable molecular risk group, normal karyotype, and NPM1 as well as DNMT3AR882 mutations were associated with higher therapy-induced senescence levels. Other therapeutic AML agents, namely hydroxyurea, decitabine and gemtuzumab ozogamicin were also shown to induce senescence. Finally, in a consecutive ex vivo treatment with daunorubicin (to induce senescence), followed by the “senolytic” (i.e., selectively cytotoxic to senescent cells) BCL2 inhibitors venetoclax and navitoclax, both growth and viability of AML blasts were additionally reduced compared to single-agent treatments only in senescence-capable samples. To the best of my knowledge, this is the first study providing direct evidence that cellular senescence, induced ex vivo in patient-derived AML blasts by chemotherapeutic drugs, could serve as a predictive biomarker of long-term response to standard therapy. I believe that therapy-induced senescence might explain, at least in part, the underlying biology of current paraclinical risk indicators, and, as an outlook, might serve as a guidance for future personalized treatment of AML.

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine heterogene Erkrankung, für die die Entwicklung neuer pathophysiologisch fundierter prädiktiver Biomarker von großer klinischer Notwendigkeit ist. Zusätzlich zu apoptotischem Zelltod von Tumorzellen können antineoplastische Medikamente zu einem dauerhaften Zellzyklusarrest viabler, metabolisch aktiver Tumorzellen führen, welches Phänomen als Therapie-induzierte Seneszenz in verschiedenen Tumorentitäten charakterisiert wurde. Die prognostische und prädiktive Relevanz Therapie-induzierter Seneszenz für den Verlauf von Tumorerkrankungen ist derzeit unklar. Außer einer Induktion durch Chemotherapeutika kann Seneszenz u.a. durch replikativen Stress oder Onkogen-Expression hervorgerufen werden und dient dadurch als initiale zelluläre Barriere gegen maligne Entartung. Die langfristige Bedeutung von im Organismus persistierenden seneszenten Tumorzellen bleibt jedoch unklar, da diese durch ihren Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) auch proinflammatorisch wirken und durch epigenetische Veränderungen Krebsstammzelleigenschaften aufweisen können. In ex vivo-Untersuchungen an aus Patient:innenproben zum Zeitpunkt der Diagnosestellung gewonnenen AML-Blasten konnte ich zunächst „basale“ und Therapie-bedingte Seneszenz in der AML charakterisieren um daraufhin Seneszenz als prädiktiven Biomarker zu analysieren. Nach Etablierung von Primärkulturbedingungen für die zytostatische Behandlung (und somit mögliche Seneszenzinduktion) aufgereinigter AML-Blasten konnte ich mit zytochemischen und Fluoreszenz-basierten Assays die Zunahme der Seneszenz-assoziierten-β-Galaktosidase (SA-β-gal)-Aktivität und anderer Seneszenzmarker nachweisen. Durch RNA-Sequenzierung konnte meine experimentelle Klassifikation individueller AML-Proben als „Seneszenz-fähig“ anhand Seneszenz-assoziierter Genexpressionssignaturen bestätigt und weiter charakterisiert werden. Zur Analyse der prädiktiven Bedeutung Therapie-bedingter Seneszenz wurden die einzelnen AML Proben weiter molekulargenetisch untersucht und experimentelle Ergebnisse mit dem jeweiligen klinischen Verlauf individueller Patient:innen korreliert. Ich konnte zeigen, dass die intraindividuelle Induzierbarkeit von Seneszenz durch ex vivo-Behandlung mit dem AML-Standardchemotherapeutikum Daunorubicin positiv mit einem verbesserten erkrankungsfreien Überleben und Gesamtüberleben korrelierte. Zudem waren eine günstigere molekulare Risikogruppe, ein normaler Karyotyp sowie NPM1- und DNMT3AR882-Mutationen mit höheren Leveln Therapie-induzierter Seneszenz assoziiert. Durch die Behandlung mit anderen AML-Therapeutika wie Hydroxyurea, Decitabin oder Gemtuzumab-Ozogamicin konnte ebenfalls Seneszenz ausgelöst werden. Schließlich konnten ich durch eine konsekutive ex vivo-Behandlung mit zunächst Daunorubicin (zur Seneszenzinduktion) und darauffolgend mit den „senolytisch“ wirkenden (d.h. selektiv zytotoxisch gegenüber seneszenten Zellen) BCL2-Inhibitoren Venetoclax und Navitoclax sowohl Zellzahl als auch Viabilität seneszenzfähiger AML-Proben im Vergleich zu einer Therapie mit den Einzelsubstanzen oder zu AML-Proben, welche nicht seneszenzfähig waren, zusätzlich reduzieren. Nach meinem Kenntnisstand konnte im Rahmen dieses Promotionsprojektes erstmals nachgewiesen werden, dass durch ex vivo-Chemotherapie in aus Patient:innen gewonnenen AML-Blasten induzierte zelluläre Seneszenz als prädiktiver Biomarker für das langzeitige Therapieansprechen auf die Standard-Induktionstherapie dienen kann. Möglicherweise erklärt Therapie-induzierte Seneszenz Teilaspekte der etablierten paraklinischen Risikofaktoren zugrundliegenden Tumorbiologie und kann perspektivisch als Marker für personalisierte Behandlungskonzepte in der AML verwendet werden.