Vergleich unterschiedlicher Methoden zur Quantifizierung der Adhäsion von Moraxella catarrhalis an pulmonalen Epithelzellen und Etablierung eines neuen Fluoreszenz-basierten Adhäsionsassays

Abstract

M. catarrhalis ist der zweithäufigste Erreger der bakteriell bedingten Exazerbation der COPD. Die Adhäsion ist ein entscheidender Pathogenitätsfaktor von M. catarrhalis. Über Interaktionen zwischen Adhäsinen und Rezeptoren ist wenig bekannt. Zur Quantifizierung bakterieller Adhäsion an Epithelzellen wurden bisher ein auf der Auszählung von colony- forming units (cfu-basiertes Assay) und ein auf der mikroskopischen Auszählung von adhärenten Bakterien pro einzelner Zelle basierender Adhäsionsassay (Mikroskopie-basiertes Assay) verwandt. Die simultane Visualisierung und Quantifizierung von Bakterien auf konfluenten Monolayern ist nicht möglich. Ziel dieser Arbeit war es, einen neuen Fluorszenz-basierten Adhäsionsassay zu entwickeln und mit den o.g. Assays an verschiedenen Zelllinien (Bronchialepithelzelllinie BEAS-2B, Lungenkarzinomzelle A549, Larynxkarzinomzelle HEp-2) zu vergleichen. Verwendet wurden die M. catarrhalis Stämme ATCC 25238 und O35E. Mit dem neuen Fluoreszenz-basierten Assay ließ sich eine Zeit- und Dosisabhängigkeit der Adhäsion beider M. catarrhalis Stämme an BEAS-2B Zellen zeigen. Die Ergebnisse des cfu-basierten Assays zeigten signifikante Unterschiede zwischen den Stämmen, was auf Bildung von Bakterienaggregaten auf der Zelloberfläche erklärt werden konnte, die durch Konfokalmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie nachgewiesen werden konnten. Während sich bei der Adhäsion von M. catarrhalis an BEAS-2B Zellen kein Unterschied fand, wurden mittels des Mikroskopie-basierten Assays an den einzeln ausgezählten nicht- konfluenten A549 und HEp-2 Zellen signifikant weniger adhärente M. catarrhalis nachgewiesen als mit den anderen Assays, was mit Unterschieden des Oberflächenrezeptorenbesatzes zwischen nicht-konfluenten und konfluenten Zellen dieser Zelllinien erklärt werden kann. Durch die Bildung von Bakterienaggregaten auf Epithelzellen bzw. Unterschiede zwischen konfluenten und nicht konfluenten Monolayern können Ergebnisse des Mikroskopie-basierten und des cfu-basierten Adhäsionassays verfälscht werden. Der neue Fluoreszenz- basierte Assay kann bakterielle Adhäsion am konfluenten Monolayer valide visualisieren und quantifizieren

Moraxella catarrhalis is a major cause of infectious exacerbations of chronic obstructive lung disease. Adhesion of this pathogen to epithelial cells is critical for its pathogenicity. Although much work has been done on identifying surface molecules of M. catarrhalis as adhesins, several adhesion assays were used in these studies which has never been validated or compared to each other. In the present study, we have examined the capacity of M. catarrhalis to adhere to different human epithelial cells. By using the two most commonly used adhesion assays based on the enumeration of colony-forming units or on the counting of adherent bacteria per epithelial cell by light microscopy, we identified significant limitations of both methods. These arose either from differences in strain-specific adhesion pattern on the epithelial cell surface or the dependence on the state of confluence of the epithelial cell layer. We developed a new fluorescence-based adhesion assay and compared our results to the two conventional methods. We demonstrated that the fluorescence- based adhesion assay offers a reliable and convenient method for the quantification of M. catarrhalis adhesion to confluent epithelial cell monolayers.