Role of brain-enriched microRNAs during neural development

Abstract

The discovery of microRNAs has revealed an unexpected and spectacular additional level of fine tuning of the genome. MicroRNAs (miRNAs) are a class of 22 nucleotide, non-coding, regulatory RNAs that inhibit the translation of mRNAs by binding to cognate sites of imperfect complementarity found in 3’ untranslated regions in their target genes. To date, thousand of miRNA genes have been identified and each miRNA may potentially target many different (ten to hundreds) mRNAs. miRNAs are particularly highly expressed in the brain and they are involved in brain development and function by controlling the temporal and spatial expression of target genes. Several intriguing studies have linked miRNAs as major regulators of the neuronal phenotype, and have implicated specific miRNAs in the regulation of synapse formation and plasticity. Dysfunction of miRNA pathway is also a potential important contributor to the pathogenesis of major neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s or Parkinson’s diseases. Unfortunately, to date relatively little is known about the role of individual miRNAs in neural development and nervous system function. Therefore, the main aim of this work was to elucidate potential functions of brain enriched miRNAs (let-7, miR-125, miR-124 and miR-128) during neural development. Functional assays were developed and used to compare the activities of four selected miRNAs: let-7, miR-125, miR-124 and miR-128 in embryomic stem (ES) cells, primary cortical neurons at stage E15 and E18 and in a neural stem cell line generated in the course of this thesis. Activity of let-7 and miR-125 was shown to start early in progenitor cell differentiation, suggesting a potential role of both miRNAs as inhibitors of ES cell selfrenewal. miR-124 activity was observed in primary neurons at E15, consistent with a role in neuronal lineage determination. miR-128 was active after E15, suggesting a potential role during neuronal maturation. As a starting point for the functional investigation of miR-124 and miR-128, gain of function experiments were performed in vitro and in vivo. miR-124 overexpression in NS cells undergoing astrocytic differentiation failed to adopt astrocytic morphology and showed certain characteristics of developing neurons. Ectopic overexpression of miR-124 was also performed in E12 cortical progenitors in utero. In this experiment, miR-124 expressing cells formed large aggregates and failed to distribute into the overlying cortical layers. Premature miR-128 expression in the E15 cortex resulted in aberrant migration, preventing migration into upper cortical layers in late embryonic development. In order to identify functionally relevant genes as miRNA targets, an in vitro assay was established in Hek293 cells. GFP constructs bearing the 3’UTR of putative target genes were generated and co-transfected with appropriate miRNA mimics. With this assay, several predicted miRNA target genes could be confirmed. Moreover, two novel pluripotency genes, Lin-41 and Lin-28, were identified as let-7 and miR-125 targets. Experiments with Lin-41 and Lin-28 revealed that both proteins act together in embryonic stem cells and inhibit the maturation and activity of let-7. In addition, let-7 and miR-125 competitive inhibition experiments were performed in neural stem cells. For this purpose miRNA sponge constructs, bearing up to 64 semi-complementary binding sites for a given miRNA were generated. Introduction of miR-125 or let-7 sponges in Lin-41-, Lin-28- neural stem cells led to a de-repression of Lin-28 and Lin-41, resulting in posttranscriptional inhibition of let-7 and therefore a partial restoration of the pluripotent state. Taken together, these experiments defined previously unrecognized autoregulatory interactions among let-7, miR-125, Lin-28 and Lin-41 acting during stem cell commitment.

Zusammenfassung MicroRNAs, eine Klasse nicht kodierender RNAs mit einer Länge von ca. 22 Nukleotiden, inhibieren die Translation von messenger-RNAs durch imperfekte Bindung an bestimmte Sequenzen in der 3’UTR ihrer Zielgene. Bis heute konnten tausende dieser regulatorischen miRNAs identifiziert werden. Jede dieser miRNAs besitzt potentiell die Möglichkeit, viele unterschiedliche (zehn bis hunderte) messenger-RNAs zu regulieren. Der Großteil aller miRNAs wird im zentralen Nervensystem (ZNS) exprimiert. miRNAs regulieren die Funktion und Entwicklung des ZNS durch räumliche und zeitliche Regulation ihrer Zielgene. Einige Studien haben miRNAs als Hauptregulatoren des neuronalen Phänotyps identifiziert, welche unter anderem die synaptische- und kortikale Plastizität regulieren. Die Pathogenese viele neuronaler Störungen, wie z.B. Alzheimer und Parkinson konnten mit funktionellen Störungen der miRNA-Biogenese in Verbindung gebracht werden. Leider ist bis heute wenig über einzelne miRNAs und deren Einfluß auf die Neuralentwicklung und Funktion im ZNS bekannt. Deshalb war es ein Hauptziel dieser Arbeit, Funktionen der besonders stark im Gehirn angereicherter miRNAs (let-7, miR-125, miR-124 und miR-128) und deren Einfluß auf die Neuralentwicklung eingehender zu untersuchen. Hierzu wurde ein funktioneller Ansatz etabliert um die miRNA Aktivität von let- 7, miR-125, miR-124 und miR-128 in embryonalen Stammzellen, in primären kortikalen Neuronenkulturen zweier Embryonalstadien E15 und E18 und in neuronalen Stammzellen zu bestimmen. Die Aktivität von let-7 und mir-125 konnte bereits in neuronalen Vorläuferzellen nachgewiesen werden, was darauf hinweist, daß diese miRNAs die Selbsterneuerung embryonaler Stammzellen inhibiert. Die Aktivität von miR-124 konnte bereits in frühen kortikalen Neuronen im Entwicklungsstadium E15 nachgewiesen werden. miR-128 war dagegen erst in späten kortikalen Neuronen im Entwicklungsstadium E18 aktiv und könnte somit an der Hirnreifung beteiligt sein. Für funktionelle Studien wurden gain- of-function Experimente von miR-124 und miR-128 sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführt. Neuronale Vorläuferzellen, welche miR-124 ektopisch überexpremierten, waren nicht in der Lage in Astrocytendifferenzierungsmedium zu Astrozyten differenzierten und wiesen einen neuronalen Phänotyp auf. Überexpression von miR-124 wurde auch in kortikalen Vorläuferzellen von E12 Mausembryonen in utero überexprimiert. In diesem Experiment bildeten miR-124 überexprimierende Zellen große Zellanhäufungen welche nicht mehr in der Lage waren in den darüber liegenden Kortex zu immigrieren. Eine zu frühe Expression von miR-128 in E15 kortikalen Vorläuferzellen führte dagegen zu einer anormalen Migration transfizierter Zellen innerhalb des Kortex, durch Verhinderung der Migration in darüber liegende kortikalen Schichten. Um funktionell relevante Kandidaten-Gene als miRNA Zielgene zu identifizieren, wurde ein in vitro System in HEK293 Zellen etabliert. Hierzu wurden GFP Konstrukte, welche den 3’UTR möglicher miRNA Zielgene beinhalteten, generiert und mit entsprechenden miRNAs cotransfiziert. Mit Hilfe dieses Ansatzes konnten einige vorhergesagte Zielgene bestätigt werden. Zudem konnten zwei pluripotente Gene, Lin-41 und Lin-28 als let-7- und miR-125 Zielgene identifiziert werden. Weitergehende Untersuchungen von Lin-41 und Lin-28 konnten zeigen, daß beide Proteine zusammen die Reifung und Aktivität von let-7 in embryonalen Stammzellen verhindern und somit Rückkopplungskreis bilden. Um miRNAs zu inhibieren, wurden miRNA ―Schwamm‖-Konstrukte, welche bis zu 64 halbkomplementäre Bindestellen für bestimmte miRNAs besitzen, generiert. Die Transfektion von Lin-28-/Lin-41- neuronalen Stammzellen mit miR-125 oder let-7 Schwamm-Konstrukten führte zu einer de-Repression von Lin-28 und Lin-41 und somit zu einer post-tranksriptionalen Inhibierung von let-7 und dadurch zu einer partiellen Restauration des pluripotenten Stadiums. Zusammengefaßt zeigen diese Experimente eine zuvor nicht bekannte autoregulatorische Interaktion zwischen let-7, miR-125, Lin-28 und Lin-41, welche während des Stammzellstadiums aktiv ist.