Zebrafish as a model for regenerative studies - from dissecting the effects of cryoinjury to the cellular diversity of heart repair

Abstract

Zebrafish is an excellent model to study cardiac regeneration. This freshwater teleost fish can fully regenerate its heart after myocardial infarction (MI) within one to two months after the injury. Cryoinjury method is widely used to induce the injury in the zebrafish heart since it mimics the closest human MI. Current protocols used in adult zebrafish, including cryoinjury method, do not involve any analgesia treatment and they do not take into consideration the adverse effects that can arise out of these techniques. Nociception is a basic response of the animal to harmful external or internal stimuli, which is essential for survival and adaptability to the environment. Fish can react to noxious stimuli, similarly to the higher vertebrates, which should be considered in the design of scientific experiments. In this study, I showed that cryoinjury is a noxious stimulus for zebrafish by assessing zebrafish behaviour Moreover, I showed that morphine treatment for 6h after the cryoinjury procedure, but not lidocaine, significantly improved zebrafish behaviour using swimming speed as a readout. Importantly, the morphine treatment for 6h did not impair regeneration based on histological analysis and did not affect regenerative capacities based on the transcriptome analysis using scRNA-seq and qPCR. We advise using morphine as the analgesic of choice to reduce adverse effects associated with the cryoinjury procedure in adult zebrafish. The refinement of the current cryoinjury protocol allowed us to investigate cellular drivers of zebrafish heart repair with consideration of zebrafish welfare with the improved protocol. Several pro-regenerative factors and signalling pathways are known to be crucial for zebrafish heart regeneration, however, the cellular composition of the zebrafish regenerating heart and cell types involved in the process are still incompletely understood. To systematically investigate the diversity of activated cell states in the zebrafish regenerating heart, we used single cell transcriptomics and spatiotemporal analysis. We showed that upon the injury there is a significant induction of several cell states with fibroblasts characteristics and we confirmed the pro-regenerative role of transient col12a1a-expressing fibroblasts. To determine the origin of transient cell states, we performed Cre/lox lineage tracing, in order to understand the events leading to heart regeneration. We reported that transient fibroblasts can originate both from epicardium and endocardium, similarly to the development process. We also identified Wnt signalling as a key regulator of endocardial-derived fibroblasts, which was at least partially mediated by the impaired revascularization during regeneration. In this study, we identified the great diversity of specialized activated fibroblasts as one of the factors crucial for zebrafish heart regeneration, which gives us new possibilities towards improving mammalian heart repair.

Der Zebrafisch ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Herzregeneration. Dieser Süßwasser-Teleostfisch kann sein Herz nach einem Myokardinfarkt (MI) innerhalb von ein bis zwei Monaten nach der Verletzung vollständig regenerieren. Die Kryo-Verletzungsmethode wird weitgehend verwendet, um die Schädigung des Zebrafischherzens herbeizuführen, da sie dem menschlichen MI am nächsten kommt. Die derzeit bei erwachsenen Zebrafischen angewandten Protokolle, einschließlich der Kryoverletzungsmethode, beinhalten keine Analgetikabehandlung und berücksichtigen nicht die nachteiligen Auswirkungen, die sich aus diesen Techniken ergeben können. Die Nozizeption ist eine grundlegende Reaktion des Tieres auf schädliche äußere oder innere Reize, die für das Überleben und die Anpassungsfähigkeit an die Umwelt unverzichtbar ist. Fische können ähnlich wie die höheren Wirbeltiere auf schädliche Reize reagieren, was bei der Planung wissenschaftlicher Experimente berücksichtigt werden sollte. In dieser Studie konnte ich zeigen, dass die Kryoverletzung ein schädlicher Reiz für Zebrafische ist, indem ich das Verhalten der Zebrafische untersuchte. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass die Behandlung mit Morphin für 6 Stunden nach der Kryoverletzung, nicht aber mit Lidocain, das Verhalten der Zebrafische deutlich verbesserte, wobei die Schwimmgeschwindigkeit als Indikator verwendet wurde. Wichtig ist, dass die 6-stündige Morphin-Behandlung die Regeneration laut histologischer Analyse nicht beeinträchtigte und sich auch nicht auf die Regenerationsfähigkeit auswirkte, wie die Transkriptomanalyse mittels scRNA-seq und qPCR ergab. Wir empfehlen die Verwendung von Morphin als geeignetes Analgetikum, um unerwünschte Wirkungen im Zusammenhang mit der Kryoverletzung bei erwachsenen Zebrafischen zu vermindern. Die Verfeinerung des aktuellen Kryo-Verletzungsprotokolls ermöglichte es uns, die zellulären Triebkräfte der Zebrafisch-Herzreparatur unter Berücksichtigung des Wohlergehens der Zebrafische mit dem verbesserten Protokoll zu untersuchen. Es ist bekannt, dass mehrere regenerationsfördernde Faktoren und Signalwege für die Regeneration des Zebrafischherzens von entscheidender Bedeutung sind. Die zelluläre Zusammensetzung des Zebrafischherzens und die Zelltypen, die an diesem Prozess beteiligt sind, sind jedoch noch unvollständig bekannt. Um die Vielfalt der aktivierten Zellzustände im regenerierenden Zebrafischherz systematisch zu untersuchen, haben wir Einzelzelltranskriptomik und raum-zeitliche Analysen eingesetzt. Wir konnten zeigen, dass nach der Verletzung eine signifikante Induktion verschiedener Zellzustände mit Fibroblastencharakteristika stattfindet, und wir bestätigten die pro-regenerative Rolle von transienten col12a1a-exprimierenden Fibroblasten. Wir identifizierten ebenso den Wnt-Signalweg als einen wichtigen Regulator der aus dem Endokard stammenden Fibroblasten, der zumindest teilweise durch die beeinträchtigte Revaskularisierung während der Regeneration vermittelt wurde. In dieser Studie haben wir die große Vielfalt an spezialisierten aktivierten Fibroblasten als einen der entscheidenden Faktoren für die Regeneration des Zebrafischherzens identifiziert, was uns neue Möglichkeiten zur Verbesserung der Herzreparatur bei Säugetieren eröffnet.