Reconstructed full-thickness skin (RHS) and reconstructed epidermis (RHE) has proven a promising alternative to preclinical drug testing on animal (pig, mouse) skin, which should be overcome both due to ethical concerns and species-related differences that question the predictive power. Constructed from juvenile cells, the available models omit changes that occur in the skin during ageing. Reconstructed epidermis that can mimic age-related changes is particularly relevant with regard to the growing population of elderly people. Previous approaches to meet this need included the use of a glycated dermis equivalent to reflect age-related glycosylation, or fibroblasts prematurely aged by replicative senescence through prolonged cultivation or drug-induced senescence by mitomycin treatment. Here, it was intended to induce senescence in juvenile keratinocytes by UV-light and to construct UV-RHE. Single doses of UV-B (25 mJ/cm2) are sufficient to cause senescence in keratinocytes, as indicated by expression of senescence-associated (SA)-ß-galactosidase and characteristic morphology (flattening, size increase and strong granulation). Keratinocytes irradiated with 25 mJ/cm2 UV-B and one lower dose, 9.6 mJ/cm2, and non-irradiated control keratinocytes, respectively, were seeded into inserts and cultivated for 14 days to form normal RHE and UV-RHE. In parallel, the effect of the UV irradiation on cell viability and proliferation was investigated in keratinocyte monolayers. It was found that 25 mJ/cm2 UV-B reduced the viability to about 30 % 72 h post-irradiation. The cell proliferation decreased by about 25 % at the same dose after 72 h. Moderate effects were detected for the lower dose. The normal and UV-RHE were investigated after 14 days. The normal RHE displayed the appropriate regular pattern of erect keratinocytes in the basal lamina and was fully stratified, while the UV-RHE showed an irregular pattern, indicating disturbed differentiation. The most obvious distinction was a dose-dependent reduction in the epidermal layers: in 25 mJ/cm2 UV-RHE, the stratum corneum shrunk by 56 % (p≤0.01) and in 9.6 mJ/cm2 UV-RHE by about 30 %. The thickness of the viable epidermis was also reduced, although less remarkably. Since the effects were demonstrably not caused by fluctuations in the seeding numbers and the keratinocyte count in normal and UV-RHE was not markedly changed, the reduction presumably resulted from flattened keratinocytes and/or exfoliated corneocytes. The thinning of the epidermal layers nicely paralleled the epidermal atrophy in vivo, where senescent cells cause structural and functional alterations of the tissue. In order to test the influence of the UV stress on the secretion of pro-inflammatory cytokines, IL-1α, IL-6, IL-8, IL-12, and TNFα were tested. Only IL-1α and IL-8 were above the detection limit and were elevated in 25 mJ/cm2 UV-RHE throughout the cultivation by about twofold compared to normal RHE. IL-1α levels were highest at day 2 and preceded elevated IL-8 levels from day 7 to 14. Elevated IL-1α and IL-8 levels are part of the senescence-associated secretory phenotype (SASP) that is characteristic of the chronic inflammation of aged tissues. Increased ß-galactosidase protein levels in tissue lysates were at least detectable for two batches of 25 mJ/cm2 UV-RHE. Together with the monolayer results of increased ß-galactosidase expression and the elevated IL-1α and IL-8 levels, the existence of senescent cells in UV-RHE in accordance with ageing tissues in vivo is strongly suggested. To investigate the barrier function of normal and UV-RHE, the permeation of two OECD reference compounds was tested. Caffeine and testosterone both permeated UV-RHE faster than normal RHE, and despite relatively strong inter-batch differences clearly pointed to barrier impairment in 25 mJ/cm2 UV-RHE in agreement with structural and functional alterations of the stratum corneum in the elderly. Also, the uptake of core- multishell (CMS-) nanocarriers was tested. CMS nanocarriers are promising as efficient drug transporters for the treatment of skin diseases; yet their penetration into aged skin with altered barrier function, critical for their risk assessment, had not been investigated. In accordance with the decreased barrier of 25 mJ/cm2 UV-RHE, an increased penetration of indocarbocyanine- tagged nanocarriers by comparison to normal RHE of about twofold into the stratum corneum and about six fold into the viable epidermis was detectable via FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy). Taken together, a new type of reconstructed epidermis was built from UV-B stressed keratinocytes that was able to capture the most evident hallmarks of skin ageing in vivo. The resemblance to aged human epidermis was given in terms of morphology, increased IL-1α and IL-8 secretion, senescence-associated ß-galactosidase expression and increased permeation and penetration.
Rekonstruierte humane Vollhaut- (RHS) und Epidermismodelle (RHE) für die präklinische Testung sind eine vielversprechende Alternative zu den ethisch bedenklichen Tierversuchen. Ihr entscheidender Vorteil ist, dass sie, anders als Schweine- oder Maushaut, aus menschlichen Zellen aufgebaut werden und damit das Problem artspezifischer Unterschiede umgehen. Da RHS und RHE stets aus juvenilen Spenderzellen generiert werden, sind die strukturellen und funktionalen Unterschiede, wie sie in gealterter Haut auftreten, in diesen Modellen bisher nicht ausreichend berücksichtigt. Aufgrund eines zunehmenden Bevölkerungsanteils älterer Menschen ist die entsprechende Anpassung ein wichtiges Ziel. Bisherige Ansätze zur Modellierung von Hautalterung beinhalteten unter anderem die Verwendung eines gykosylierten Dermisäquivalents sowie die Induktion von Seneszenz durch verlängerte Kultivierdauer oder Gabe von Mitomycin. Der hier gewählte Ansatz beschreibt die Induktion von Seneszenz in juvenilen Keratinozyten durch UV-Stress. Einmalige Bestrahlung mit UV-B (25 mJ/cm2) kann Seneszenz in juvenilen Keratinozyten hervorrufen, wie durch 1.5 fache Erhöhung seneszenz-assoziierter ß-Galaktosidaseexpression und charakteristischer Veränderungen der Zellmorphologie (Abflachung, Oberflächenvergrößerung und starke Granulierung des Zytoplasmas) gezeigt. Mit zwei verschiedenen UV-Dosen (25 mJ/cm2; 9.6 mJ/cm2) bestrahlte Zellen, sowie die Zellen der unbestrahlten Kontrolle wurden über 14 Tage zu normaler bzw. UV-RHE kultiviert. Der Effekt der UV-Strahlung auf Viabilität und Proliferation wurde am Monolayer untersucht, mit bis zu 30 % verringerter Viabilität und 25 % verringerter Proliferation bei 25 mJ/cm2 UV-B 72 h nach der Bestrahlung. Nach dem Ende der 14-tägigen Kultivierung in Inserts zeigte die normale RHE die angemessene Ausbildung aller epidermalen Schichten sowie die typische, aufrechte Anordnung der Keratinozyten in der Basalmembran. Die UV-RHE dagegen hatte eine unregelmäßige, auf eine gestörte Differenzierung hinweisende Anordnung der basalen Keratinozyten. Am auffälligsten war jedoch der dosisabhängige Dickenunterschied der epidermalen Schichten. 25 mJ/cm2 UV-RHE hatte ein um durchschnittlich 56 % (p≤0.01) verringertes Stratum corneum (circa 30 % in 9.6 mJ/cm2 UV-RHE). Die Dicke der viablen Epidermis war ebenfalls verringert. Es konnte gezeigt werden, dass die Effekte nicht von Schwankungen der ausgesäten Zellzahl ausgelöst wurden; auch war die Gesamtanzahl der Zellen zwischen normaler und UV-RHE nicht auffällig anders. Dies läßt den Rückschluß zu, dass die verringerte Dicke durch abgeflachte und/oder die Abstoßung abgestorbener, verhornter Zellen zustande kam. Die Verdünnung stimmt überein mit der epidermalen Atrophie gealterter Haut, in der seneszente Zellen zu Struktur- und Funktionsveränderungen beitragen. Darüber hinaus wurde die Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine (IL-1α, IL-6, IL-8, IL-12 und TNFα) getestet. Nur IL-1α und IL-8 waren oberhalb des Detektionslimits und über die gesamte Kulturdauer circa zweifach erhöht in 25 mJ/cm2 UV-RHE gegenüber der normalen RHE. Der Spiegel an IL-1α war maximal erhöht nach zwei Tagen und ging den erhöhten Spiegeln von IL-8 zwischen Tag 7 und 14 voraus. Erhöhte Sekretion von IL-1α und IL-8 sind Teil des seneszenz-assoziierten sekretorischen Phenotyps (SASP), charakteristisch für die chronischen, niedrigschwellig entzündlichen Prozesse, die in alter Haut beobachtet wurden. Außerdem wurde in 25 mJ/cm2 UV-RHE von wenigstens zwei Spendern erhöhte ß-Galaktosidaseexpression nachgewiesen. Zusammen mit den entsprechenden Ergebnissen aus dem Monolayer und der erhöhten IL-1α und -8 Sekretion sprechen die Ergebnisse für das Vorhandensein seneszenter Zellen in der UV-RHE, übereinstimmend mit dem Vorkommen seneszenter Zellen in gealterter Haut. Zur Untersuchung der Barrierefunktion wurde die Permeation von zwei OECD-Referenzsubstanzen getestet. Koffein und Testosteron permiierten durch UV-RHE schneller als durch die normale RHE. Trotz relativ starker spenderabhängiger Unterschiede wurde ein klarer Trend zur verringerten Barrierefunktion in 25 mJ/cm2 UV-RHE festgestellt, in Übereinstimmung mit den strukturellen und funktionalen Veränderungen des Stratum corneums in gealterter Haut. Weiterhin wurde die Penetration von core-multishell- (CMS-) Nanocarriern getestet, die als innovative Transportsysteme für Wirkstoffe zur Behandlung von Hautkrankheiten entwickelt wurden. Obwohl bereits vielversprechende Ergebnisse vorliegen, ist ihre Risikobewertung noch nicht abgeschlossen; so wurden sie beispielsweise noch nicht auf der veränderten Barriere von gealterter Haut getestet. Passend zur verringerten Barriere der 25 mJ/cm2 UV-RHE konnte eine gegenüber der normalen RHE zweifache (in das Stratum corneum) und sechsfache (in die viablen Schichten) erhöhte Penetration von mit Indocarbocyanin markierten Nanocarriern festgestellt werden (detektiert mittels FLIM, Fluorescence lifetime imaging microscopy). Insgesamt wurde eine neuartige rekonstruierte Epidermis aus UV-gestressten Keratinozyten aufgebaut, die die wichtigsten Kennzeichen in vivo gealterter Haut abbilden konnte. Die Ähnlichkeit zeigte sich in der Morphologie, erhöhter IL-1α und IL-8 Sekretion, seneszenz-assoziierter ß-Galaktosidaseexpression sowie erhöhter Permeation und Penetration.
