Nanoscale segregation of claudin-10a, -10b and -15 enables paracellular ion permeability

Abstract

Located between the epithelium's and endothelium's outer cells, the tight junction (TJ) acts as a semi-permeable barrier in the paracellular cleft. It balances two crucial functions: the protection of the tissue from the outer environment (pathogens, toxins) and the maintenance of the organ homeostasis by providing paracellular ion and macromolecule permeability. The TJ connects adjacent epithelial cells as a meshwork-like structure consisting of multiple interconnected strands. The strands are formed by a specific group of tetra-span transmembrane proteins, the claudin (Cldn) family. Since the discovery of its first members in 1998, the claudin family has expanded rapidly to 26 members in mammals. The fundamental role of claudins is to provide sealing and specific channel properties to the TJ by forming paracellular contact interfaces with their extracellular loop (ECL) domains. Inherent claudin mutations, and pathogens that target specific claudins can cause changes in the TJ structure resulting in severe chronic diseases. The nanoscale organization of claudins that enables their specific function, and their rearrangement under pathological conditions has yet to be investigated. The greatly apical and axial localization, together with the highly complex multi-protein-based structure of the TJ, make nanoscale imaging of various proteins and dynamics a sophisticated and nearly impossible task. In recent years, a couple of studies indicated the great potential of super-resolution fluorescence microscopy in solving this problem without exhausting it thoroughly. Here, we could show for the first time that stimulated emission depletion (STED) microscopy in combination with advanced labeling techniques can resolve the TJ meshwork structure. In this way we could provide novel insights into the specific nano-organization principles of claudins in in vitro overexpression and mammalian tissue. Automated computational comparison of the TJ-like meshwork forming properties of all 26 mammalian claudins revealed that claudins differ in their ability to form meshwork and can be grouped into three classes based on their meshwork structure. Co-overexpression of barrier-forming Cldn3 and channel-forming Cldn2 with other claudins uncovered five different nano-interaction patterns: intermixing, integration, induction, segregation, and exclusion. Focusing on the nano-segregation of the channel-forming claudins Cldn10a, Cldn10b, and Cldn15, we could verify this novel interaction pattern on an endogenous level for Cldn2 and Cldn10a in whole isolated kidney tubules, as well as for Cldn3 and Cldn15 in the duodenum. By testing how different extrinsic (functional inhibition of the Cldn2 pore, depletion of cholesterol, and diminishing of the PDZ binding motif) and intrinsic factors (deletion of the claudin C-terminus and claudin chimeras) influenced segregation, we could determine that the segregation is conserved in the ECLs of the claudins. By reintroducing single channel- and barrier-forming claudins and segregating claudin pairs in a novel genetically modified epithelial cell line, which lacks the TJ meshwork due to a quintuple claudin knockout, we could show on a functional level the relevance of segregation as a novel indispensable requirement for the formation of ion-specific paracellular channels and its necessity for a constant ion diffusion over the TJ meshwork.

Die tight junction (TJ) agiert im parazellulären Raum zwischen den äußersten Zellen des Epitheliums und Endotheliums als semipermeable Diffusionsbarriere. Als dichte Verbindung zwischen benachbarten Epithel- und Endothelzellen übt die TJ zwei elementare Funktionen aus: den Schutz des Gewebes vor der äußeren Umgebung (Pathogene und Toxine) und die Aufrechterhaltung der Gewebe Homöostase durch ihre passive Permeabilität für Ionen, Wasser und Makromolekülen. Bestehend aus mehreren miteinander verbundenen Strängen bildet die TJ eine Netzwerk-artige Struktur aus, die sich entlang des gesamten Zell-Zell Kontakts zieht. Die einzelnen Stränge des Netzwerks werden von Trans-Membran Proteinen aus der Claudin (Cldn) Familie gebildet. Seit ihrer Entdeckung im Jahr 1998 ist die Familie auf eine Anzahl von 26 Claudinen in Säugetieren angewachsen. Claudine nehmen eine fundamentale Rolle in der Ausbildung und Funktion der TJ ein, indem sie die TJ mit Barriere und spezifischen Ion-Kanal bildenden Eigenschaften ausstatten. Ihre elementar wichtigen Funktionen sind auf die Interaktionen ihrer extrazellulären Domänen (EZDs) und die damit verbundene molekulare Anordnung im parazellulären Spalt zurückzuführen. Vererbbare Mutationen in Claudinen und durch Pathogene hervorgerufene Veränderungen der TJ-Struktur können zur Ausbildung schwerer chronischer Krankheiten führen. Die Nano-Organisation der Claudine, welche ihre spezifische Funktion ermöglicht und die dynamischen Veränderungen des TJ Netzwerkes unter pathologischen Konditionen sind bislang weitestgehend unbekannt und müssen untersucht werden. Die apikale und axial zur optischen Ebene gerichtete Lokalisation einer vollausgebildeten TJ sowie die sehr dichte und aus mehreren Proteinen geformte komplexe TJ-Struktur hat es bislang zu einem sehr anspruchsvollen, wenn nicht unmöglichen Unterfangen gemacht multiple Claudine in einem TJ-Netzwerk zu mikroskopieren und deren einzelne Dynamik zu definieren. In den letzten Jahren haben erste wissenschaftliche Studien mit hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie eine mögliche Lösung des Problems aufgezeigt, dennoch wurde das dahinterstehende Potential nicht ansatzweise ausgeschöpft. In der vorliegenden Arbeit konnten wir zum ersten Mal demonstrieren, dass stimulated emission depletion (STED) Mikroskopie in Kombination mit neuesten Protein Markierungstechniken, das TJ-Netzwerk auf Nanoebene auflösen kann und es ermöglicht neue Einblicke in die Organisationsprinzipien der Claudine in Überexpression und Gewebe zu bekommen. Eine automatisierte Analyse der TJ-Netzwerk bildenden Eigenschaften aller in Säugetieren exprimierten Claudine enthüllte die unterschiedlichen Fähigkeiten der Claudine, Netzwerke auszubilden und erlaubte es zum ersten Mal die Gruppierung der Netzwerk-bildenden Claudine in drei unterschiedliche Klassen. Überexpression von Cldn3, ein Barriere-bildendes Claudin, und Cldn2, ein Kanal-bildendes Claudin, zusammen mit anderen Claudinen erlaubte es uns fünf neue Nano-Interaktionen zu beschreiben: intermixing, integration, induction, segregation und exclusion. Mit Fokus auf die zum ersten Mal beschriebene Nano-Segregation der Kanal-bildenden Claudine, Cldn10a, Cldn10b and Cldn15 konnten wir auf endogenem Level die Segregation von Cldn2 und Cldn10a in isolierten murinen Nierentubuli sowie Cldn3 und Cldn15 im murinen Duodenum auflösen. Eine mechanistische Aufklärung, die verschiedenen extrinsischen Faktoren (funktionale Inhibierung der Cldn2 Pore, Depletion von Cholesterol und Verlust der Claudin-ZO1 Bindung) und intrinsische Faktoren (Deletion des Claudin C-Terminus und Claudin Chimären) einbezog, ergab, dass die Segregation in den EZDs der Claudine konserviert ist. Re-Expression von einzelnen Kanal- und Barrier-bildenden Claudinen und den segregierenden Claudin Paaren in einer genetisch modifizierten Epithelzelllinie, eine Zelllinie deren endogene TJ-Netzwerk Bildung durch einen fünffach Claudin knockout nicht mehr vorhanden ist, konnte auf funktioneller Ebene bestätigen, dass die Claudin Nano-Segregation eine notwendige Bedingung für die Bildung von funktionierenden spezifischen Ionenkanälen für die TJ darstellt und so einen konstanten Strom an Ionen über die TJ ermöglicht.