Establishment of dynamic culture conditions for the fabrication of advanced in vitro tissue models.

Abstract

In this thesis, a system for the application of flow-induced, physiologically relevant shear stress on mammalian cells was established. The circulation of cell culture medium in culture circuits was generated by peristaltic pumps, which can be operated with a self-built control unit. Culture chambers for different applications were computer-assisted designed, characterized by computational fluid dynamics and subsequently manufactured either by CNC milling or 3D printing. Using this system, shear-induced changes on the cellular functionality of in vitro barrier models were investigated. The application of low, physiologically relevant shear forces to an established intestinal epithelial cell line, HT29-MTX, resulted in increased mucus production, as well as structural reorganization of the confluent cell layer towards 3-dimensional villi-like structures. The results could be transferred from solid cell culture substrates to commercially available cell culture inserts bearing membranes, allowing us to develop an improved in vitro model of the intestinal barrier with a physiologically relevant mucus layer. We then proceeded with the endothelial barrier. Here, we investigated the effects of flow-induced stress comparatively for HUVECs and iPSC-ECs. Both cell types showed the characteristic alignment upon application of flow, as well as increased layer thicknesses and improved functionality of the endothelial glycocalyx. In addition, for the first time, we were able to detach isotropic (HUVECs) and anisotropic (iPSC-ECs) cell monolayers from thermoresponsive surfaces and wrapped them around a 3D-printed scaffold while maintaining alignment, which represents an important step toward the development of blood vessels in vitro. Finally, we implemented a similar tubular construct into dynamic culture. The indirect coculture of HUVECs with fibroblasts allowed intercellular communication and resulted in the formation of stable vascular networks, while a second independent circuit allowed perfusion of the tubular blood vessel mimick. In summary, we established a versatile and reliable platform for the application of physiological shear forces to flat and lumenized tissues, enabling the development of improved in vitro barrier models.

In dieser Arbeit wurde ein System zur Applikation fluss-induzierter, physiologisch relevanter Scherkräfte auf Säugerzellen etabliert. Die Zirkulation von Zellkulturmedium in Kulturkreisläufen wurde dabei über Peristaltikpumpen generiert, welche mit einer selbstgebauten Steuerung betrieben werden können. Kulturkammern für unterschiedliche Einsatzgebiete wurden computergestützt entworfen, mithilfe numerischer Strömungsmechanik charakterisiert und anschließend entweder durch CNC-Fräsen oder 3D-Druck hergestellt. Mithilfe dieses Systems wurde der Einfluss scherinduzierten Änderungen auf die zelluläre Funktionalität von in vitro Barrieremodellen untersucht. Die Applikation geringer, physiologisch relevanter Scherkräfte auf eine etablierte intestinale epitheliale Zelllinie, HT29-MTX, führte zu einer erhöhten Mucusproduktion, sowie der strukturellen Reorganisation der konfluenten Zellschicht hin zu 3-dimenionalen, Darmzotten-artigen Gebilden. Die Ergebnisse konnten von festen Zellkultursubstraten auf kommerziell erhältliche Zellkultureinsätze mit mikroporösen Membranen übertragen werden, sodass wir ein verbessertes in vitro Modell der intestinalen Barriere mit physiologisch relevanten Mucusschichten entwickeln konnten. Im Anschluss widmeten wir uns dem Studium der Barrierefunktion von Endothelzellen. Dabei untersuchten wir die Auswirkungen von fluss-induziertem Stress vergleichend für HUVECs und iPSCs-ECs. Beide Zellarten zeigten die charakteristische Ausrichtung mit dem Fluss, sowie erhöhte Schichtdicken und verbesserte Funktionalität der endothelialen Glykokalix. Zudem konnten wir erstmalig intakte isotrope (HUVECs) und anisotrope (iPSC-ECs) Zellmonolagen temperatur-gesteuert von thermoresponsiven Oberflächen ablösen und um ein 3D-gedrucktes Gerüst rollen, wobei die Zellausrichtung erhalten blieb, was einen wichtigen Schritt zur Entwicklung von Blutgefäßen in vitro darstellt. Abschließend implementierten wir ein ähnliches Konstrukt in die dynamische Kultur. Die Erweiterung des Systems durch eine indirekte Kokultur der HUVECs mit Fibroblasten ermöglichte die Ausbildung stabiler, vaskularer Netzwerke und ein zweiter unabhängiger Kreislauf erlaubte die Perfusion der künstlichen tubulären Blutgefäße. Zusammenfassend konnten wir eine vielseitige und verlässliche Plattform zur Applikation von physiologischen Scherkräften auf adhärenten Säugerzellen in 2D oder in 3D etablieren, die den Aufbau von verbesserten in vitro Barrieremodellen ermöglicht.