Probiotic effects on epithelial barrier properties and inflammatory response in an infection model of the porcine intestine

Abstract

The probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 (hereafter called E. faecium) is a licensed feed additive for pigs in the EU. Piglets supplemented with E. faecium showed a decreased incidence and severity of post-weaning diarrhea in previous studies. The main cause of postweaning diarrhea in piglets is infection with enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). However, the underlying cellular mechanisms of the protective effects of E. faecium against ETEC infection have only rarely been analyzed. Therefore, the present study investigated the effects of the probiotic E. faecium on epithelial barrier properties and cytokine expression in the intestinal porcine epithelial cell line J2 (IPEC-J2) during an infection with ETEC in vitro. A decrease of the transepithelial electrical resistance (Rt) in ETEC-infected cells was detected that was not seen in cells pre-incubated with E. faecium. These observations confirmed the results of a former study conducted at our institute. The expression of tight junction (TJ) proteins analyzed in the present study was not influenced by incubation with the bacterial strains. However, a modulation of the cell structure was seen in ETEC-infected cells, i.e. cells arranged on top of each other, indicating increased cell shedding. This was not seen in ETEC-infected cells pre-incubated with E. faecium. The rate of apoptosis was not modulated by ETEC. However, the cytotoxicity that significantly increased in ETEC-infected cells, was ameliorated by pre-incubation with E. faecium. At the mRNA level, ETEC upregulated the proinflammatory cytokine tumor necrosis factor (TNF)-α and increased the release of the cytokines TNF-α, interleukin (IL)-1α, and IL-6 at the protein level. A protective effect of the probiotic could be detected for the ETEC-induced increased TNF-α mRNA expression and IL-6 protein release. Both were decreased by preincubation of cells with E. faecium. The second messenger 3′,5′-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) was also elevated by ETEC, but this was counteracted in cells preincubated with E. faecium. In a further part of the present study, the inflammasome was analyzed as a potential mediator of probiotic effects. First, the basal expression of inflammasome components was analyzed at the mRNA level in the intestine of piglets and fattening pigs. The expression of nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3 (NLRP3), NLRP6, apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (ASC), caspase-1, IL-1β, and IL-18 was detected in the jejunum, ileum, and colon of pigs. A characteristic expression pattern was revealed for NLRP6, ASC, and caspase-1 in 29-day-old piglets that showed a decreasing expression of these components in an oral-aboral direction. Such expression pattern could not be detected in 70-day-old fattening pigs. Furthermore, the effects of the probiotic E. faecium on the mRNA expression of inflammasomes and inflammasome components were analyzed in a feeding trial. Piglets supplemented with E. faecium showed increased mRNA expression of ASC in the jejunum. The mRNA expression of NLRP3, NLRP6, caspase-1, IL-1β, and IL-18 was not modulated by the probiotic. In order to analyze probiotic effects during an infection with a pathogen, the jejunum of 80-dayold pigs was incubated with E. faecium, ETEC, E. faecium and ETEC, or without bacteria in an Ussing chamber experiment ex vivo. The mRNA expression of the inflammasome components was not modulated by the bacterial strains. However, at the protein level, the release of IL-1β was significantly increased by ETEC. A protective effect was found for the probiotic E. faecium. ETEC-induced increased release of IL-1β protein was significantly reduced by pre-incubation with E. faecium. In conclusion, several protective effects of the probiotic E. faecium have been detected at the cellular level during ETEC infection in the present work. The probiotic effects were mediated via the reduced decrease in Rt, the downregulated expression and release of inflammatory cytokines, the decreased intracellular concentrations of cAMP, the maintenance of the physiological epithelial cell structure, and the lessening of cytotoxic effects during ETEC infection. A characteristic oral-aboral expression pattern was revealed for the inflammasome NLRP6 and the inflammasome component ASC and caspase-1 in the intestine of piglets. The detected expression pattern was similar to the expression pattern in humans thereby reinforcing the use of pigs as an animal model for preclinical and translational inflammasome research. Pre-incubation with E. faecium reduced the ETEC-induced release of IL-1β protein. IL-1β release is associated with inflammasome activation. Hence, the present study provides evidence for the inflammasome as a mediator of protective probiotic effects at the functional level during infection with ETEC ex vivo. The protective effects of E. faecium demonstrated in this study represent important findings concerning the cellular mode of action of the probiotic during ETEC infection. Based on these findings, the prophylactic use of E. faecium can be considered for the reduction of the incidence and severity of ETEC infections in piglets as a very promising strategy. The latter has the potential to decrease the necessity of the therapeutic use of antibiotics in pig farming.

Das Probiotikum Enterococcus faecium NCIMB 10415 (im Folgenden E. faecium genannt) ist als Futterzusatzstoff für Schweine in der EU zugelassen. Ferkel, welche ein mit E. faecium supplementiertes Futter erhielten, zeigten in früheren Studien ein geringeres Auftreten und einen weniger schwerwiegenden Verlauf von Ferkeldurchfällen. Hauptverursacher von Durchfällen bei Absetzferkeln sind enterotoxische Escherichia coli (ETEC). Die zugrundeliegenden zellulären Effekte, über welche E. faecium protektive Effekte bei einer ETEC-Infektion vermittelt, wurden bisher kaum erforscht. Die vorliegende Dissertation untersuchte zunächst den Einfluss des Probiotikums E. faecium auf die epitheliale Integrität und Zytokinfreisetzung während einer in vitro Infektion mit ETEC in der porzinen intestinalen epithelialen Zelllinie J2 (IPEC-J2). ETEC verursachte einen Abfall des transepithelialen Widerstandes (Rt). Dieser Abfall wurde durch Präinkubation mit E. faecium vermindert. Dies bestätigte das Ergebnis einer vorherigen Studie an unserem Institut. Die in der vorliegenden Dissertation untersuchten Tight-Junction (TJ)-Proteine wurden durch die Inkubation mit den verschiedenen Bakterienstämmen nicht beeinflusst. Jedoch zeigten die mit ETEC infizierten Zellen eine Veränderung ihrer Struktur im Zellverband. Einzelne Zellen ragten aus dem Zellverband heraus, nachdem sie mit ETEC inkubiert wurden. Dies weist auf eine erhöhte Abschilferung dieser Zellen hin. Die Veränderung war nicht zu erkennen, wenn die Zellen zuvor mit E. faecium präinkubiert wurden. Die Apoptose-Rate der Zellen wurde durch ETEC nicht beeinflusst. Jedoch bewirkte die Inkubation mit ETEC eine erhöhte Zytotoxizität in den Zellen, welche durch Präinkubation mit E. faecium vermindert werden konnte. Des Weiteren wurden durch die Inkubation der IPEC-J2 Zellen mit ETEC auf mRNA-Ebene das proinflammatorische Zytokin Tumornekrosefaktor (TNF)-α vermehrt exprimiert und auf Protein-Ebene die Zytokine TNF-α, Interleukin (IL)-1α und IL-6 im höheren Maße ausgeschüttet. Hierbei konnte ein protektiver Effekt des Probiotikums E. faecium festgestellt werden, indem die ETEC-induzierte erhöhte Expression von TNF-α mRNA sowie die gesteigerte Ausschüttung von IL-6 Protein unterbunden wurde. Zudem wurde durch ETEC die Konzentration des sekundären Messengers cyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) in den Zellen erhöht, welche in Zellen, die mit E. faecium präinkubiert wurden, nicht anstieg. Um das Inflammasom als potentiellen Vermittler probiotischer Effekte zu untersuchen, wurde zunächst das Vorkommen von Komponenten des Inflammasoms im Darm von Absetzferkeln und Mastschweinen auf mRNA-Ebene untersucht. Die mRNA Expression von NLRP3, NLRP6, ASC, Caspase-1, IL-1β und IL-18 konnte im Jejunum, Ileum und Colon von Schweinen nachgewiesen werden. Ein charakteristisches Expressionsmuster, welches eine Abnahme der Expression von oral nach aboral zeigte, wurde für NLRP6, ASC und Caspase-1 bei 29 Tage alten Absetzferkeln entdeckt. Bei 70 Tage alten Mastschweinen war dieses Expressionsmuster nicht mehr zu erkennen. In einem weiteren Versuch wurde der Einfluss des Probiotikums E. faecium auf die mRNA Expression von Komponenten des Inflammasoms in einem Fütterungsversuch mit E. faecium erforscht. Mit E. faecium gefütterte Ferkel zeigten eine erhöhte mRNA Expression von ASC im Jejunum. Die mRNA Expression von NLRP3, NLRP6, Caspase-1, IL-1β und IL-18 wurde durch die Fütterung mit dem Probiotikum nicht beeinflusst. Um Effekte des Probiotikums während einer Infektion mit einem Pathogen zu analysieren, wurde in einem Ussingkammer-Versuch Jejunum von 80 Tage alten Schweinen ex vivo mit E. faecium, ETEC, E. faecium und ETEC sowie ohne Bakterien inkubiert. Die Expression der untersuchten Komponenten des Inflammasoms wurde durch die Inkubation mit den verschiedenen Bakterien nicht beeinflusst. Jedoch wurde auf Protein-Ebene die Ausschüttung von IL-1β durch ETEC signifikant erhöht. Das Probiotikum E. faecium zeigte hierbei einen protektiven Effekt, indem es die ETEC-induzierte erhöhte Expression von IL-1β reduzierte. Zusammenfassend konnten in der vorliegenden Arbeit mehrere protektive Effekte des Probiotikums E. faecium während einer Infektion mit ETEC auf zellulärer Ebene nachgewiesen werden. Diese protektiven probiotischen Effekte wurden über einen verminderten Abfall des Rt, eine reduzierte Expression und Ausschüttung inflammatorischer Zytokine, eine geringere Konzentration von cAMP in den Zellen, die Erhaltung der physiologischen epithelialen Zellstruktur und verminderte zytotoxische Effekte während einer Infektion mit ETEC vermittelt. Für das Inflammasom NLRP6 und die Inflammasom-Komponenten ASC und Caspase-1 wurde ein charakteristisches oral-aborales Expressionsmuster im Darm von Absetzferkeln entdeckt, welches mit dem Expressionsmuster des Menschen übereinstimmt und das Schwein als Versuchstier für die präklinische und translationale Inflammasom-Forschung prädestiniert. Durch Präinkubation mit E. faecium wurde die Ausschüttung des proinflammatorischen Zytokins IL-1β, welches durch Aktivierung des Inflammasoms freigesetzt wird, im ETECinfizierten Gewebe reduziert. Das Inflammasom als Vermittler probiotischer Effekte konnte somit auf funktioneller Ebene während einer ex vivo Infektion mit ETEC nachgewiesen werden. Die in dieser Dissertation entdeckten protektiven Effekte des Probiotikums E. faecium liefern wichtige Erkenntnisse über die Wirkungsweise des Probiotikums während einer Infektion mit ETEC auf zellulärer Ebene. Der prophylaktische Einsatz von E. faecium zur Reduzierung des Auftretens und Minderung des Schweregrades einer ETEC-Infektion bei Ferkeln kann auf Grundlage der in dieser Arbeit beschriebenen protektiven Effekte als sehr vielversprechende Methode angesehen werden, die das Potential hat die Notwendigkeit eines therapeutischen Einsatzes von Antibiotika in der Schweinehaltung bei dieser Erkrankung zu reduzieren.