Transkriptionelle Regulation der Genexpression der Tight junction-Proteine Claudin-1 und Claudin-2 durch den Wnt-Signalweg

Abstract

Die Ausbildung der Tight junction ist ein Schlüsselereignis bei der Differenzierung polarisierter epithelialer Zellen. Claudine sind Transmembran- Proteine und integraler Bestandteil der Tight junction. Claudin-1 ist ein abdichtendes Barriereprotein, dessen essentielle Bedeutung für die Regulation des Wassertransports bereits in der Haut gezeigt werden konnte. Claudin-2 hingegen spielt durch seine Fähigkeit, kationense-lektive Poren innerhalb der Tight junction auszubilden, eine entscheidende Rolle für die parazelluläre Barriere. Physiologische und pathophysiologische Veränderungen der epithelialen Barrierefunktion gehen mit Änderungen der Expression von Tight junction-Proteinen einher. Diese Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der molekularen Mechanismen der Regulation der Genexpression von Claudin-1 und Claudin-2. Genomische DNA, welche die Promotorsequenz des humanen Claudin-1 bzw. Claudin-2 enthält, wurde mittels Reportergen-Analyse funktionell charakterisiert. Die Aktivität der Promotoren von Claudin-1 und Claudin-2 war in einer murinen epithelialen Zelllinie, welche stabil Wnt-1 exprimiert, erhöht. Das sekretorische Glykoprotein Wnt-1 ist ein extrazellulärer Aktivator des Wnt-Signalwegs, der an der Regulation der zellulären Differenzierung und Proliferation beteiligt ist. Für LEF-1, einen nukleären Effektor des Wnt- Signalwegs, konnte eine direkte Interaktion mit spezifischen Bindungsstellen in den Promotoren von Claudin-1 und Claudin-2 gezeigt werden. Die Expression von LEF-1 und beta-Catenin führte zu einer Erhöhung der Claudin-1- bzw. Claudin-2-Promotoraktivität. Diese Aktivierung war nach einer Mutation der LEF-1-Bindungsstellen in den Promotoren vermindert. Auch für einen weiteren Effektor des Wnt-Signalwegs, TCF-4, ließ sich eine Steigerung der Claudin-1- bzw. Claudin-2-Promotoraktivität nachweisen. Hieraus lässt sich folgern, dass die Genexpression der humanen Tight junction-Proteine Claudin-1 und Claudin-2 durch den Wnt-Signalweg reguliert werden. Ein weiteres bedeutsames Ergebnis war, dass für die Claudin-2-Promotor-vermittelte Genexpression ein funktioneller Crosstalk zwischen dem Wnt-Signalweg und der Caudal-Related- Homeobox-Protein (Cdx)-abhängigen Transkrip-tionsaktivierung nachgewiesen werden konnte. Dies zeigt, dass die Regulation der Claudin-2 Genexpression komplexen Interaktionen verschiedener Signalwege unterliegt und nicht einer einzelnen linearen Signalkaskade folgt. Die differentielle Ausstattung verschiedener Epithelien mit unterschiedlichen Tight junction-Proteinen ist entscheidend für die parazelluläre Barriere. Die Regulation dieser differentiellen Expressionen erfolgt in den Stadien der zellulären Differenzie-rung und Polarisierung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass zwei wichtige Signalwege dieser Differenzierungs- und Polarisierungsvorgänge, nämlich der Wnt-Signalweg und die Transkriptionsfaktoren der Cdx-Familie an der Regulation der Expression von Claudinen beteiligt sind.

Assembly of the tight junction is a key event in the differentiation of polarized epithe-lial cells. Claudins are transmembrane proteins and an integral part of the tight junction. Claudin-1 is a barrier protein, whose essential role in the sealing of the paracellular space has already been shown in native skin epithelium. Claudin-2 on the other hand plays a crucial role for the paracellular barrier because of its ability to form cation selective pores in the tight junction. Physiological and pathophysiological changes of the epithelial barrier are accompanied by changes in the expression of tight junction proteins. This work deals with the examination of molecular mechanisms in the regulation of claudin-1 and claudin-2 gene expression. Genomic DNA containing promoter sequences of human claudin-1 and claudin-2 were functionally characterized by reportergene assay. Promoter activity of claudin-1 and claudin-2 was elevated in a murine epithelial cell line, which expresses Wnt-1. The secretory glycoprotein Wnt-1 is an extracellular activator of the Wnt signaling pathway, which regulates cell differentiation and proliferation. For LEF-1, a nuclear effector of the Wnt signaling pathway, a direct interaction with specific binding motives in the promoters of claudin-1 and claudin-2 was shown. The expression of LEF-1 and beta-catenin resulted in an elevation of claudin-1 and claudin-2 promoter activity. Mutation of the LEF-1 binding sites led to a diminution of this activation. Another nuclear effector of the Wnt signal-ing pathway, TCF-4, showed also an elevation of claudin-1 and claudin-2 promoter activity. This suggests, that the Wnt signaling pathway regulates gene expression of the human tight junction proteins claudin-1 and claudin-2. Another important result was the verification of a functional crosstalk between Wnt signaling pathway and caudal related homeobox protein (Cdx) mediated transcriptional activation of claudin-2 promoter activity. The regulation of claudin-2 gene expression is therefore sub-jected to complex interactions of different signaling pathways. The differential configuration of diverse epithelia with varying tight junction proteins is crucial for different paracellular barrier properties. The regulation of this differential expression takes place in the phases of cellular differentiation and polarisation. This work could demonstrate, that the Wnt signaling pathway and the Cdx mediated transcriptional regulation, two important signaling pathways for differentiation and polarisation, are involved in the regulation of claudin gene expression.