Behandlung von Pseudomonas aeruginosa-Biofilmen mithilfe von Bakteriophagen

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es zu analysieren, ob mit einem Phagencocktail aus den beiden Bakteriophagen vB_Pae-TbilisM32 und vB_Pae-CS2310 einer Entstehung von P. aeruginosa-Biofilmen vorzubeugen ist, sowie bereits etablierte Biofilme beseitigt werden können. Die Experimente wurden sowohl bei dem P. aeruginosa-Temperaturoptimum von 37 °C durchgeführt, als auch bei 12 °C, was die Bedingungen in lebensmittelverarbeitenden Betrieben abbilden sollte. Zunächst wurde das Wirtsspektrum der Phagen ermittelt, welches für vB_Pae-TbilisiM32 bei 53 % der untersuchten P. aeruginosa-Wildstämme lag und für vB_Pae-CS2310 bei 80 %. Für die weiteren Untersuchungen wurden sechs gegenüber beiden Phagen sensible Stämme ausgewählt, mit denen zunächst in Flüssigmedium der Einfluss beider Phagen sowie des Cocktails auf die Zellzahl bei 37 °C untersucht wurde. Dabei wurde eine rasante Reduktion, gefolgt von einer schnellen Erholung der Zellzahl beobachtet. Bei 12 °C konnte durch Zugabe des Phagencocktails ebenfalls eine Reduktion der Zellzahl erreicht oder zumindest deren Ansteigen verhindert werden. Die Prävention der P. aeruginosa-Biofilmbildung erwies sich sowohl bei 37 °C als auch bei 12 °C als äußerst erfolgreich, lediglich bei 37 °C waren zwei der Stämme nicht durch den Cocktail beeinflusst. Die Bekämpfung der etablierten P. aeruginosa-Biofilme hingegen verlief nach unterschiedlichen Mustern. Während bei 37 °C nach 6 h eine deutliche Reduktion zu erkennen war, waren nach 24 h bereits wieder hohe optische Dichten zu messen, die zumeist sogar über der der Vergleichskontrolle lagen. Bei 12 °C hingegen war nach 72 h eine stärkere Reduktion der Biofilmmasse zu erkennen als nach 24 h. Die am Ende der Versuche gewonnene P. aeruginosa-Klone waren trotz des Überlebens in Co-Kultur mit den Bakteriophagen häufig weiterhin sensibel gegenüber den Phagen. Bei der anschließend durchgeführten Genanalyse konnten keine Hinweise auf eine den Resistenzen zugrundeliegende Genveränderung gefunden werden. Da jedoch bis auf die 31 genauer untersuchten Gene nur nach vollständigen Gendeletionen gesucht wurde, kann eine Resistenz aufgrund einer Mutation in anderen Genen nicht ausgeschlossen werden. Weitere Untersuchungen, die mögliche Mutationen mit einbeziehen, sind anzustreben. Daneben kommen allerdings auch phänotypische Resistenzen als Ursache infrage. Durch veränderte Genexpression und damit einhergehender Maskierung oder reduzierter Ausbildung der Phagenrezeptoren setzt einige Zeit nach Phagenzugabe ein Anstieg der Zellzahl ein, die Bakterien bleiben aber weiterhin sensibel gegenüber den eingesetzten Phagen. Die verschiedenen aufgetretenen Resistenzmuster lassen sich auch durch das Forcieren der bakteriellen Heterogenität bei Zugabe von Bakteriophagen erklären. Für eine Applikation in vivo sollte der hier untersuchte Bakteriophagencocktail noch weiter verbessert werden. Zwar ist er in der Prävention von P. aeruginosa-Biofilmen schon sehr erfolgversprechend, jedoch entwickeln sich sowohl in Flüssigmedium als auch in einer Biofilmformation schon nach kurzer Zeit Resistenzen. Eine Erweiterung des Cocktails um zusätzliche P. aeruginosa-Phagen sowie eine Kombinationstherapie mit Chemikalien wie Chlor wäre ebenfalls anzustreben. Zudem sollten die Zielrezeptoren der eingesetzten Phagen weiterhin gesucht und das zugrundeliegende Resistenzmuster in weiterführenden Studien vollständig abgeklärt werden. Auch wäre von Interesse, ob die Resistenzen gegen den Phagencocktail die Virulenz von P. aeruginosa reduzieren, was einen therapeutischen Einsatz trotz der Resistenzen in medizinischen Bereichen ermöglichen könnte.

The aim of this study was to analyse if a cocktail of the two bacteriophages vB_Pae-TbilisiM32 and vB_Pa-CS2310 is able to prevent the formation of a P. aeruginosa biofilm as well as to eliminate an already established biofilm. The experiments were carried out at the optimum temperature of P. aeruginosa, 37 °C, and at 12 °C, to represent the conditions in the food processing industry. At first, the host range of both phages was determined, resulting in 53 % of the examined P. aeruginosa wild-type strains in vB_Pae-TbilisiM32 and 80 % in vB_Pae-CS2310. Following this, six of these P. aeruginosa strains were chosen, all of which were sensitive to both phages. With these strains, the influence of the two phages and a cocktail of both was tested in liquid culture at 37 °C. Rapid reduction of the bacterial number was observed, followed by fast cell count recovery. At 12 °C, the cocktail was also able to reduce the cell count, or at least to prohibit an increase of the cell count in some strains. Prevention of P. aeruginosa biofilm formation was successful at both 37 °C and 12 °C. Only two strains weren't affected by the cocktail at 37 °C. However, the elimination of the established biofilms wasn't consistent. After 6 h at 37 °C a distinct reduction of the biofilms could be observed, while after 24 h strong biofilm masses occurred again, with optical densities above the media control. By contrast, the progression at 12 °C showed a stronger reduction of the biofilm masses after 72 h than after 24 h. At the end of the experiments, clones were obtained, and even when they survived in coculture with the bacteriophages, plenty of them remained sensible to the used phages and cocktail. The genetic analyses of the bacterial strains did not result in any evidence of genetic change causing resistances. However, apart from the 31 selected genes, only complete gene deletions were investigated, which means that mutations in other genes remain possible. Further investigations regarding the mutations are necessary. Apart from that, phenotypic resistances may also cause survival of bacteria. A slightly changed genetic expression may result in a different formation or masking of the phage receptors. In this case, in a short period after adding the phages, the cell count increases, but the bacteria remain sensible to the phages. Adding bacteriophages is forcing a heterogeneity of the bacteria, which explains the different resistance patterns. To be applied in vivo, the phage cocktail used in this study should be advanced. Although it is already very promising in the prevention of P. aeruginosa biofilms, the resistances in liquid culture and already established biofilms develop in a concise period. Therefore, the cocktail should be extended by further P. aeruginosa phages and used in combination with other therapeutic agents like chlorine. In further studies, the binding receptor of both phages should be examined, and the causal resistance pattern should be investigated. Furthermore, it would be interesting to investigate, if the resistance against the phage cocktail is reducing the virulence of P. aeruginosa. In that case, despite the resistance, a therapeutical application in medical sections would be achievable.