Hemmung des JAK/STAT3-Pathways mit JAK-Inhibitoren in Mammakarzinomen

Abstract

Breast cancer is the most common cancer in women. In addition to chemotherapy and anti-hormonal therapy, targeted therapies are increasingly used in the treatment of breast cancer. The overactivation of various signal transduction pathways including the PI3K/AKT/mTOR and JAK/STAT pathway is substantial in breast cancer growth. In the present work, the in vitro activity of several potential targeted therapies was investigated on breast cancer cell lines. First, the activity of two JAK inhibitors, INK424 and NVP-BSK805-NX-9 (BSK805), was investigated using cell viability assay (MTT assay) on breast cancer cell lines. BSK805 alone led to a moderate cell viability reduction at high concentrations. In contrast, the breast cancer cell lines did not show any sensitivity to INK424, even at maximum concentration. These results suggested that inhibition of a single pathway alone may not be sufficient to induce proliferation inhibition and apoptosis. Due to the known crosstalk between PI3K/AKT/mTOR and JAK/STAT pathway, the JAK2 inhibitor BSK805 and the PI3K inhibitor NVP-BYL719 (BYL-719/ alpelisib) were combined. Significant proliferation inhibition was shown. In addition, nucleosome enrichment in Cell Death Detection ELISAPLUS and cleavage product of the apoptosis key protein PARP in western blot were increased, showing significantly enhanced apoptosis for the breast cancer cell lines BT-20 and ZR-75 under inhibitor combination. Further activity enhancement of JAK2 inhibition was suspected in combination with PIM kinase inhibitors. PIM kinases are also controlled by JAK/STAT signaling and regulate the proliferation of breast cancer cells. The pan-PIM-inhibitor LGB321 showed minimal inhibition of proliferation in most of the tested cell lines. In combination with BSK805, enhanced cytostatic and cytotoxic effects were observed. Cell line BT-474, showed increased apoptosis in Cell Death Detection ELISAPLUS and western blot in inhibitor combination of BSK805 and LGB321. In conclusion, breast cancer cells in-vitro showed little sensitivity to JAK2 inhibition alone. Inhibiting additional survival pathways, however, resulted in synergistic or additive effects. The additional inhibition of the PI3K/AKT/mTOR pathway or PIM kinase, respectively, significantly increased the proliferation inhibitory effect associated with cell cycle arrest and apoptosis induction in breast cancer cells. The combination of JAK2 inhibitor with PI3K- or pan-PIM kinase inhibitors requires further investigation to assess clinical applicability.

Das Mammakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung der Frau. Neben Chemotherapie und antihormoneller Therapie finden in der Behandlung des Mammakarzinoms immer häufiger zielgerichtete Substanzen Anwendung. Beim Mammakarzinom kommt es zur Überaktivierung diverser Signaltransduktionswege, u. a. des JAK/STAT- und des PI3K/AKT/mTOR-Signaltransduktionswegs. In der vorliegenden Arbeit wurde die in-vitro-Aktivität mehrerer potenzieller zielgerichteter Substanzen an Mammakarzinomzelllinien untersucht. Zunächst wurde die Aktivität von zwei JAK-Inhibitoren, INK424 und NVP-BSK805-NX-9 (BSK805), mit Hilfe von Zellviabilitätstests (MTT-Tests) an Mammakarzinomzelllinien untersucht. BSK805 allein führte in hoher Konzentration zu einer moderaten Zellviabilitätsreduktion. Gegenüber INK424 zeigten sich die Mammakarzinomzelllinien auch bei maximaler Konzentration nicht sensibel. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die alleinige Hemmung eines Signaltransduktionswegs möglicherweise nicht ausreicht, um eine Proliferationshemmung und Apoptose zu induzieren. Aufgrund des bekannten Crosstalk zwischen PI3K/AKT/mTOR- und JAK/STAT-Signaltransduktion wurde der JAK2-Inhibitor BSK805 mit dem PI3K-Inhibitor NVP-BYL719 (BYL719/ Alpelisib) kombiniert. Es zeigte sich eine signifikante Proliferationsinhibition. Darüber hinaus stiegen sowohl die Nukleosomenanreicherung im Cell Death Detection ELISAPLUS als auch die Spaltproduktmenge des Apoptoseschlüsselproteins PARP im Western Blot deutlich an, was sich auf eine signifikant erhöhte Apoptose bei den Brustkrebszelllinien BT-20 und ZR-75 unter Inhibitorkombination zurückführen lässt. Eine weitere Aktivitätsverstärkung der JAK2-Inhibition wurde in der Kombination mit PIM-Kinase-Inhibitor vermutet. PIM-Kinasen stehen unter der Kontrolle des JAK/STAT-Signaltransduktionswegs und sind an der Proliferation von Mammakarzinomzellen beteiligt. Der pan-PIM-Kinase-Inhibitor LGB321 zeigte bei der Mehrheit der getesteten Zelllinien eine geringfügige proliferationsinhibierende Wirkung. In Kombination mit BSK805 waren jedoch deutliche zytostatische und zytotoxische Wirkungen zu beobachten. Die Zelllinie BT-474 zeigte bei Inhibitorkombination aus BSK805 und LGB321 im Cell Death Detection ELISAPLUS und Western Blot ebenfalls verstärkt Apoptose. Zusammenfassend waren alle getesteten Mammakarzinomzellen in-vitro gegenüber einer alleinigen JAK2-Hemmung wenig sensibel. Die Kombination mit Inhibitoren weiterer Signaltransduktionswege zeigte jedoch eine synergistische oder additive Wirksamkeit. Durch die zusätzliche Hemmung des PI3K/AKT/mTOR-Signaltransduktionswegs bzw. von PIM-Kinasen verstärkte sich die antiproliferative Wirkung, die mit Zellzyklusarrest und Apoptose-Induktion assoziiert ist, signifikant. Die Kombination aus JAK2-Inhibitor mit PI3K- bzw. pan-PIM-Kinase-Inhibitor sollte zukünftig weiter untersucht werden, um eine klinische Anwendbarkeit zu prüfen.