Charakterisierung des myeloiden Compartments in Patienten*innen mit ANCA-assoziierten Erkrankungen mittels CyTOF

Abstract

Mikroskopische Polyangiitis (MPA), Granulomatose mit Polyangiitis (GPA) und Eosinophile Granulomatose mit Polyangiitis sowie die renal limitierte NCGN gehören zu den Multisystem-Vaskulitiden mit Hauptlokalisation in den kleinen Gefäßen. Antineutrophile cytoplasmatische Autoantikörper (ANCA) sind gerichtet gegen MPO oder PR3 der polymorphkerniger neutrophilen Granulozyten (PMN) und spielen eine zentrale Rolle in der Pathogenese. Die Interaktion zwischen ANCA und Neutrophilen resultiert in einer endothelialen Schädigung und Zerstörung der Gefäßwände. Obwohl ANCA als pathogenetisch angenommen werden, fließen in den Prozess bis zur Destruktion der Gefäßwände viele unterschiedliche Faktoren mit ein, welche die Aktivierung der Effektorzellen initiieren, amplifizieren, aufrechterhalten und letztendlich in die Endphase und das Vollbild einer Entzündungsreaktion münden. Solche Faktoren finden sich im Bereich des Komplementsystems, der Integrine, der Fc-Rezeptoren, der MHCII-Moleküle und diverser intrazellulärer Proteine. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll konzipiert zur Prüfung der Existenz einer AAV prädisponierenden Subpopulation der neutrophilen Granulozyten und Monozyten. In einer CyTOF-basierten Multiparameteranalyse wurden 20 Oberflächen- und 6 intrazelluläre Marker aufgenommen. Ausgewählt wurden Antikörper gegen Oberflächenmoleküle aus der Klasse der Integrine, der Komplement-Rezeptoren, der Fc-Rezeptoren sowie Antikörper gegen MHCII, HLA-DR und intrazelluläre Proteine als Repräsentanten der inneren Signalkaskaden. Betrachtet wurden Zellen aus dem Vollblut von aktiven AAV-Patient*innen (n=8) und Patient*innen in Remission (n=12) im Vergleich mit gesunden Proband*innen (n=8). Ein stabiles Muster der einzelnen Marker im Kollektiv der Erkrankten ließ sich nicht erkennen und somit die Hypothese einer prädisponierenden Subpopulation nicht bestätigen. Im Vergleich der drei Gruppen traten einige Marker durch signifikante Unterschiede der MFI besonders hervor. CD88 auf der Oberfläche der PMN und Monozyten war im Vergleich zwischen aktiven Patient*innen und solchen in Remission signifikant höher im akuten Krankheitsstadium. Ähnliche Resultate fanden sich auch für C5L2 und IL-17A allerdings nur für Monozyten. Bei der Betrachtung der PMN zeigte CD64 im akuten Stadium der AAV höhere MFI-Werte als in Remission und in gesunden Kontrollen. Auf Seiten der Monozyten fielen eine Abnahme von MHCII und HLA-DR und eine Hochregulation von CD16 in der akuten Krankheitsphase verglichen sowohl mit den sich in Remission befindlichen Patient*innen als auch den gesunden Kontrollen auf. Die Ergebnisse lassen zwar nicht auf die Existenz einer AAV prädisponierenden Subpopulation schließen, jedoch geben sie Hinweise auf eine Gewichtung einiger Marker und eine Phänotypänderung der Effektorzellen während des akuten Krankheitsstadiums. Weitere Studien mit größeren Fallzahlen und zudem einer detaillierteren SPADE-Analyse sind für die Zukunft zu empfehlen.

Microscopic polyangiitis (MPA), granulomatosis with polyangiitis (GPA) and eosinophilic granulomatosis with Polyangiitis as well as renal limited NCGN are multisystem vasculitides with their main localization in smaller vessels. Antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) are directed against MPO or PR3 of polymorphonuclear granulocytes (PMN) and play a critical role in the pathogenesis of vasculitis. The interaction of ANCA with neutrophils leads to endothelial damage and the destruction of the vessels. Even though ANCA are assumed to be pathogenetic, many ascpects factor into the process leading to vascular destruction. They initiate, amplify and maintain the activation of effector cells and eventually lead to the final phase of the inflammatory reaction. Such factors are found in the complement system, the integrins, fc receptors, MHCII molecules and various intracellular proteins. In this thesis, a protocol was developed to test for an AAV predisposed subpopulation in neutrophilic granulocytes and monocytes. 20 surface and 6 intracellular markers were included in a CyTOF-based multiparameter analysis. Antibodies against surface molecules from the class of integrins (CD11a, CD11b, CD11c, CD18), complement receptors (CD35, CD88, C5L2), Fc receptors (CD16, CD32, CD64) as well as antibodies against MHCII, HLA-DR and intracellular proteins as representatives of the internal signal cascades (TNFα, IL-1β, AktP, p38-MAPK, IL-17A and IL-17F) were chosen. Cells from the blood of active AAV patients (n=8) and patients in remission (n=12) were compared to healthy donors (n=8). No stable pattern of the individual markers could be identified in the group of patients and the hypothesis of a predisposing subpopulation could therefore not be confirmed. In the comparison of the three groups, some markers stood out due to significant differences in MFI. CD88 on the surface of PMN and monocytes was significantly higher in the acute stage of the disease in comparison between active patients and those in remission. Similar results were also found for C5L2 and IL-17A, but only for monocytes. When looking at PMN, CD64 showed higher MFI values in the acute stage of AAV than in remission and in healthy controls. On the monocyte side, there was a decrease in MHCII and HLA-DR and an up-regulation of CD16 in the acute phase compared to both convalescent patients and healthy controls. While the results do not suggest the existence of an AAV predisposing subpopulation, they do provide evidence for weighting of some markers and phenotype change of effector cells during the acute stage of the disease. Further studies with the investigation of larger numbers of cases and a more detailed SPADE analysis are recommended for the future.