dc.contributor.author
Kram, Dominic Andreas
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:12:28Z
dc.date.available
2009-01-06T10:30:34.290Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/3539
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-7739
dc.description.abstract
ZUSAMMENFASSUNG In vitro Testsysteme bieten vielseitige Analysemöglichkeiten
bei der Suche nach neuen antiparasitären Wirkstoffen, so auch gegen im Säuger
obligat intrazellulär lebende Leishmania Parasiten. Entscheidend für die
pharmakologische Relevanz ist ihre infektionsbiologische Nähe zum in vivo
Geschehen. Zudem sollten sie auch Aussagen über (Neben-) Wirkungen der
Testsubstanzen auf die Wirtszelle selbst erlauben. Das in dieser Arbeit
etablierte in vitro Leishmaniosemodell zur Testung von Naturstoffen auf ihr
antileishmanielles Potential bedient sich der Durchflusszytometrie (FACS-
Analyse). L. major Parasiten, transfiziert mit einem Gen für grün
fluoreszierendes Protein (GFP), ließen sich mit dieser Methode innerhalb ihrer
Wirtszelle detektieren und quantifizieren. Gleichzeitig wurde die Vitalität
der Wirtszelle anhand ihrer Aufnahme von Propidiumjodid (PI) gemessen. Ein
älteres Leishmaniosemodell, bei dem parasitierte und behandelte Wirtszellen
lysiert und überlebende Leishmanien über ihren Umsatz des Tetrazoliumsalzes
MTT quantifiziert werden, wurde speziell hinsichtlich der Testung von
Polyphenolen kritisch beurteilt. Verschiedene Autoren hatten bereits auf die
Möglichkeit hingewiesen, dass MTT nicht nur von lebenden Zellen, sondern auch
von zu testenden Substanzen umgesetzt werden kann. Von den hier untersuchten
phenolischen Naturstoffen traf dies insbesondere auf aromatische Verbindungen
mit vicinaler Di- bzw. Trihydroxylierung zu, während Substanzen ohne oder mit
nur einer phenolischen Hydroxygruppe – unabhängig von deren Position - mit MTT
nicht reagierten. Der MTT-Vitalitätsassay war daher für phenolische
Verbindungen mit ausgeprägtem Reduktionspotential in seiner bisherigen Form
nicht geeignet. Um falsch-positive Vitalitätsbefunde zu vermeiden und den
Assay weiter verwenden zu können, wurde vor MTT-Zugabe der Zellkulturüberstand
gewechselt. Makrophagen als typische Wirtszellen für Leishmania Parasiten sind
durch ihre Adhärenz an Zellkulturgefäße gekennzeichnet. Die Zytotoxizität von
phenolischen Verbindungen wie Gallussäure, Gallussäuremethylester und
Gallussäureethylester lag für makrophagenähnliche RAW 264.7-Zellen signifikant
höher – gemessen als verringerter MTT-Umsatz – ,wenn diese noch in Suspension
behandelt wurden als wenn sie zum Zeitpunkt der Behandlung bereits adhärent
vorlagen. Vergleichsuntersuchungen im FACS (PI-Assay) zeigten diesen
Unterschied nicht. Die selektive Lyse der Wirtszellen mittels SDS
(Natriumlaurylsulfat) ohne Schädigung der Parasiten war ein weiterer
neuralgischer Punkt des vielfach genutzten MTT-Assays. Der Fortgang der Lyse
wird mikroskopisch bestimmt und ihre Effizienz ist von vielen Faktoren
abhängig, so z.B. auch vom Teststoff selbst. Der größte Nachteil der
Lysemethode lag jedoch darin, dass eine gleichzeitige Analyse der Wirtszelle
auf zytotoxische Effekte durch die Testsubstanz nicht möglich war. Es wurde
daher nach einer Methode gesucht, welche es erlaubt sowohl die Parasitenlast
als auch den Zustand der Wirtszellen zu erfassen. Die Methode sollte zudem
einen großen Probendurchsatz bei geringem Arbeitsaufwand ermöglichen. Zuerst
wurde L. major-spezifisches Kaninchen-Antiserum produziert und hiermit – nach
Permeabilisierung der Wirtszellen – Leishmanien intrazellulär markiert und
mittels fluoreszierender Sekundärantikörper sichtbar gemacht. Es zeigte sich
jedoch, dass mit dieser Methode nicht ausreichend zwischen intrazellulär
überlebenden und toten Leishmanien unterschieden werden konnte, weshalb die
Methodik für ihren ursprünglichen Zweck verworfen wurde. Andererseits war das
Antiserum sehr gut geeignet, Leishmanien im Gewebeschnitt nachzuweisen.
Alternativ wurde ein konstitutiv GFP exprimierender L. major Stamm eingesetzt.
Das GFP-Signal erwies sich in pro- und amastigoten Leishmanien für die FACS-
Analyse als ausreichend stabil. Unterschiedliche Infektionsraten waren somit
objektiv erfassbar, bis hinab zu einem Parasiten pro Zelle. Entscheidend für
die mögliche Anwendung in einem Leishmanizidie-Assay war jedoch der Befund,
dass tote Leishmanien sehr rasch ihr Fluoreszenzsignal verlieren. In der
konventionellen Fluoreszenzmikroskopie wurde zudem gezeigt, dass die
Autofluoreszenz der Wirtszellen die Detektion des GFP-Signals nicht behindert.
Allerdings war hierbei ein Ausbleichen des GFP innerhalb von fünf Minuten zu
beobachten. Das Zytokin Interferon-g (IFN-g) ist der wichtigste immunologische
Aktivator antimikrobieller Makrophagenfunktionen. In vitro bewirkt die
Kombination IFN-g plus bakterielles Lipopolysaccharid (LPS), dass Makrophagen
ihre intrazellulären Leishmania Parasiten hocheffizient mit Hilfe toxischer
Stickoxidmetabolite (iNO) abtöten. In parallelen Versuchsserien wurden in
vitro mit L. major-parasitierte Makrophagen aus murinen Knochenmarkkulturen
(BMMF) unter anderem mit IFNg + LPS oder dem Standardmedikament gegen
Leishmaniosen, Pentostamâ, behandelt. Die relative Anzahl überlebender
Leishmanien wurde sowohl mikroskopisch (Diff-Quikâ-Färbung) als auch im FACS
bestimmt. Die Ergebnisse beider Methoden stimmten überein. Die FACS-basierte
Methode erfuhr so eine weitgehende Validierung. Parallel zur Parasitenlast
wurde mittels Griess-Assay der Nitritgehalt im Zellkulturüberstand bestimmt.
Die Rolle von iNO in der immunologischen Parasitenabwehr wurde durch Zugabe
des Enzyminhibitors L-NMMA verdeutlicht. In dessen Gegenwart war auch nach
Behandlung mit IFNg + LPS die produzierte NO-Menge deutlich reduziert (Griess-
Assay) und die Parasiten wurden nicht vollständig abgetötet (FACS-Assay). Der
FACS-Assay zur Testung von Naturstoffen auf ihr antileishmanielles Potential
umgeht gravierende Schwachpunkte des existierenden auf Wirtszelllyse und MTT-
Umsatz basierenden Testsystems. Die Methode ist zudem objektiv und für einen
großen Probendurchsatz geeignet. Die Kombination aus FACS-Assay
(Parasitenlast) und iNO-Messung (Makrophagenaktivierung) erlaubt es
abzuschätzen, ob eine Testsubstanz direkt oder indirekt durch Aktivierung der
natürlichen Abwehrmechanismen der Wirtszelle wirkt. Durch Zugabe von PI ist
zeitgleich eine erste Aussage über die allgemeine Zytotoxizität einer
Testsubstanz und somit über ihr therapeutisches Fenster möglich.
de
dc.description.abstract
SUMMARY In vitro test systems offer a wide range of analytical possibilities
in the search for new antiparasitic compounds, including such against obligate
intracellular Leishmania parasites. The pharmacological relevance of the
individual assay depends on how closely it mimics the in vivo situation.
Equally important is the assessment of (side-) effects on the host cell. An in
vitro model of leishmaniasis was established for testing natural products for
their antileishmanial potential using flow cytometry (FACS-Analysis). The
assay enabled the detection and quantification of green fluorescent protein
(GFP) gene-transfected L. major parasites within their host cell.
Simultaneously, the viability of the macrophage host cell was measured via
their uptake of propidium iodide (PI). The older "Leishmania Retrieval-Assay"
in which parasitized and treated macrophages are lysed and surviving
Leishmania quantified by their metabolism of the tetrazolium salt MTT, was
less suitable than the FACS-based method, especially when testing polyphenols.
Various authors have already pointed out, that MTT is not only metabolized by
living cells but also converted by certain chemicals. Among the tested natural
phenols, this was especially the case for vicinal di- or tri-hydroxylated
aromatic compounds, whereas compounds with no or only one phenolic hydroxyl
group – independent of its position – did not react with MTT. The MTT assay in
its simple form was therefore not suited for measuring cell viability in the
presence of phenolic compounds with strong redox potential. However, false-
positive results could be largely avoided by replacing culture supernatants by
fresh medium without phenols before adding MTT. Macrophages are the natural
host cells for Leishmania parasites and characterized by adherence to
plastics. Cytotoxicity of phenolic compounds such as gallic acid, gallic acid
methyl ester, and gallic acid ethyl ester for macrophage-like RAW 264.7 cells
was conspicuously higher – assessed as reduction of MTT metabolism – when the
cells were treated while still in suspension, than when the cells were first
allowed to adhere. Viability assessment by FACS (PI-method) did not show this
phenomenon. Selective lysis of host cells with SDS (sodium dodecyl sulfate)
without harming intracellular parasites was a further critical point of the
Leishmania retrieval assay. The progression of lysis – visually monitored
under an inverted microscope – depends on many factors, including the tested
compounds themselves. The basic deficit of this method, however, lay in its
inability to simultaneously test antileishmanial and cytotoxic effects of a
compound. A test system was needed that avoided the deficits of the MTT-assay,
and SDS-lysis and that quantified both intracellular antileishmanial effects
and cytotoxicity for the host cell. Furthermore, it should be suitable for
high-throughput screening. In a first approach, L. major-specific antiserum
was produced in rabbits in order to mark Leishmania within saponin-
permeabilized macrophages. Bound antibody was detected by fluorescent
secondary antibodies and fluorescence- or confocal laser scanning-microscopy.
Unfortunately, this method could not sufficiently distinguish dead from living
Leishmania. The antiserum, however, proved to be highly useful in histology of
Leishmania-infected tissues. In a second approach, a L. major strain was used
that constitutively accumulates GFP in its cytoplasm. Its green fluorescence
was sufficiently stabile to detect by FACS both the extracellular promastigote
and the intracellular amastigote form of the parasite. Different infection/
survival rates were easily detected down to one parasite per macrophage.
Decisive for the usefulness of GFP-Leishmania in screening for leishmanicidal
compounds, however, was the rapid disappearance of the GFP signal in dead
parasites. Furthermore, the GFP-fluorescence was sufficiently distinguishable
from macrophage autofluorescence. In conventional fluorescence microscopy, GFP
exhibited severe bleaching within minutes, but this had no negative effect on
FACS-analysis. The cytokine interferon-γ (IFN-γ) is the most important
immunological activator of macrophage antimicrobial functions. In vitro, the
combination of IFN-γ and bacterial lipopolysaccharide (LPS) stimulates
macrophages to produce toxic nitric oxides (iNO) and thus to efficiently kill
intracellular Leishmania parasites. Murine bone marrow culture-derived
macrophages (BMMΦ) were infected in vitro with GFP-L. major and treated with
IFN-γ + LPS or the standard antileishmanial Pentostam®. Surviving
intracellular Leishmania were counted under a microscope after staining with
Diff-Quik® or assessed by FACS. Both procedures provided virtually identical
results, thus validating the GFP/FACS-method. In parallel to the parasite
load, the amounts of iNO released into the supernatants was measured via
Griess-assay. The decisive role of iNO in cytokine-induced killing of
Leishmania was highlighted by adding L-NMMA, an inhibitor of inducible nitric
oxide synthase (iNOS). In the absence of L-NMMA, IFN-γ + LPS-treated BMMΦ
produced abundant iNO and killed all intracellular L. major parasites. In its
presence, only little iNO could be detected and most parasites survived. This
GFP/FACS-based method for testing natural products for their antileishmanial
potential avoids critical drawbacks (SDS-lysis, MTT-assay) of the Leishmania
retrieval-method. It is semi-automated and thus objective and suitable for
high-throughput screening. The combination of GFP/FACS-assay (detection of
viable intracellular parasites) and Griess-assay (detection of iNO-release and
macrophage activation) gives a clear indication, whether an antileishmanial
compound acts directly against the parasite or indirectly by activating
antimicrobial mechanisms of the host cell. Furthermore, by adding PI directly
before FACS analysis, it is possible to assess the general cytotoxicity of
tested compounds and thus give a first estimate on its potential therapeutic
window.
en
dc.format.extent
[10], 142 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
in vitro Testsystem
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik
dc.title
Etablierung eines in vitro Testsystems zur Untersuchung von Naturstoffen auf
antileishmanielle Effekte
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. H. Kolodziej
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. R. Burger, Prof. Dr. H. H. Borchert, Prof. Dr. B. Kleuser, Dr. I.
Siebenbrodt
dc.date.accepted
2008-12-17
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000006997-9
dc.title.translated
An in vitro method for testing natural products for antileishmanial effects
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000006997
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