Characterization of different types of stonin1 positive cellular adhesions

Abstract

Adhesion structures are critical for anchoring cells in their environment, as signaling platforms and for cell migration. In line with these diverse functionalities, there are different types of cellular adhesions. In contrast to canonical focal adhesions (FAs), reticular adhesions (RAs), also known as clathrin plaques or flat clathrin lattices lack most classical adhesome proteins, but are enriched in endocytic proteins like clathrin.

In this PhD thesis, we used different microscopic techniques (live-cell confocal microscopy, stimulated emission depletion nanoscopy, transmission electron microscopy, correlative light and electron microscopy) combined with manipulation of substrates and loss of function approaches to unravel the role of stonin1 during endocytosis, adhesion and cell migration. We here identify stonin1, a close relative of the endocytic adaptor stonin2, as a protein that predominantly localizes to diverse reticular adhesion structures. By using stonin1 as a bona fide marker for RAs, we found a much higher diversity of RAs than previously known. In particular, we found general RA structures that cannot be classified as clathrin plaques. These include retraction fibers that are formed not only during mitosis but also during migration, as well as large networks found in resting confluent cells. We furthermore discovered that stonin1 is critical for actin recruitment to RAs, suggesting a novel connection of RAs to the cytoskeleton.

Since the relationship between RAs and other types of integrin-mediated adhesions is still poorly understood, we further investigated whether connections between these structures exist. Here, we found that stonin1 containing adhesions can convert into clathrin plaques or FAs. This appears to be an entirely novel mechanism for the assembly of FAs: RAs do not only form at the sites of focal adhesion disassembly, but unexpectedly, can serve as a template for the generation of new focal adhesions.

Our observations provide new insights into the transformation and interconvertibility of cellular adhesions and highlight the diverse patterns of cellular adhesions in different environments.

Adhäsionsstrukturen sind entscheidend für die Verankerung von Zellen in ihrer Umgebung, als Signalplattformen und für die Zellmigration. Entsprechend dieser vielfältigen Funktionalitäten gibt es verschiedene Arten von zellulären Adhäsionen. Im Gegensatz zu den kanonischen fokalen Adhäsionen (FAs) fehlen in den retikulären Adhäsionen (RAs), die auch als Clathrin Plaques bezeichnet werden, die meisten klassischen Adhäsionsproteine, während sie mit endozytischen Proteinen wie Clathrin angereichert sind. In dieser Doktorarbeit haben wir verschiedene mikroskopische Techniken (konfokale Mikroskopie an lebenden Zellen, Nanoskopie mit stimulierter Emissionsdepletion, Transmissionselektronenmikroskopie, korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie) in Verbindung mit der Manipulation von Substraten eingesetzt, um die Rolle von Stonin1 bei Endozytose, Adhäsion und Zellmigration zu entschlüsseln. Wir haben hier Stonin1, einen engen Verwandten des endozytischen Adaptors Stonin2, als ein Protein identifiziert, das vorwiegend in verschiedenen retikulären Adhäsionsstrukturen lokalisiert ist. Durch die Verwendung von Stonin1 als bona fide Marker für RAs fanden wir eine viel größere Vielfalt an RAs vor als bisher bekannt. Insbesondere fanden wir allgemeine RA Strukturen, die nicht als Clathrin Plaques klassifiziert werden können. Dazu gehören Retraktionsfasern, die nicht nur während der Mitose, sondern auch während der Migration gebildet werden, sowie große Adhäsionsnetzwerke, die in ruhenden konfluenten Zellen zu finden sind. Weiterhin entdeckten wir, dass Stonin1 für die Aktin-Rekrutierung in RAs entscheidend ist, was auf eine neuartige Verbindung von RAs mit dem Zytoskelett hindeutet.

Da über die Beziehung zwischen RAs und anderen Arten von Integrin vermittelten Adhäsionen noch wenig bekannt ist, haben wir weiter untersucht, ob Verbindungen zwischen diesen Strukturen bestehen. Dabei fanden wir heraus, dass Stonin1 enthaltende Adhäsionen sich in Clathrin Plaques oder FAs umwandeln können.

Durch diesen Prozess haben wir schließlich einen neuen Mechanismus für die Bildung von FAs gefunden: RAs bilden sich nicht nur an den Stellen von FAs, sondern können überraschenderweise auch als Vorlage für die Bildung neuer FAs dienen.

Diese spezifischen Beobachtungen geben neue Einblicke in die Umwandlung zellulärer Adhäsionen und verdeutlichen die unterschiedlichen Formen zellulärer Adhäsionen in verschiedenen Umgebungen.