Migration and differentiation of murine germinal center derived B cell subsets in the course of the NP-specific immune response

Abstract

Development of B cell memory and generation of high affinity antibodies are crucially dependent on germinal centers (GC). GCs are transient structures which arise after challenge with a T cell-dependent antigen within secondary lymphoid organs, such as the spleen and lymph nodes. During the immune response activated B cells migrate to the T cell zones within the secondary lymphoid organs and acquire help from the residing antigen-specific, activated T cells. Some of these activated B cells migrate toward the B cell zones, expand rapidly and found the GCs. A number of micro-evolutionary processes occur within the GCs, leading to the production of high-affinity B cells which acquire the necessary survival signals from T cells and leave the GCs in order to differentiate into plasma cells and memory B cells. These memory B cells are able to produce antibodies other than IgM. The production of such “class switched” antibodies is important for optimizing the immune response to particular antigens, since the antibody class defines its effector functions, such as complement activation, opsonization, neutralization of bacterial toxins and mast cell activation. GCs play a major role in the development of protective immunological memory; however, they are responsible for the pathogenesis of several autoimmune and infectious diseases, such as rheumatic arthritis, hashimoto thyroiditis, sjogren syndrome, multiple sclerosis, HIV and chronic hepatitis C. It is, therefore, of significant importance to understand the dynamic of GCs and the regulating mechanisms which underlie their progress and termination. This work delivers a deeper insight into the mentioned topics by performing the following analyses: i) A kinetic of the GC B cell subsets was conducted by means of flow cytometric analyses and immunofluorescence microscopy methods. This kinetic included the spleen, blood and isolated bone marrow from femur and tibia and comprised several time points after primary and secondary challenge with NP-KLH, a model antigen often used to analyze the T-dependent immune response. ii) To monitor the migratory behavior of GC B cell emigrants, different B cell subsets, corresponding to distinct stages of GC B cell ontogeny were isolated and enriched from blood. Subsequently, these subsets were transferred into recipients at an early time point and shortly before the peak of their GC response. The localization and differentiation status of the donor B cells within spleen, bone marrow and mesenteric lymph nodes of recipients were determined during one week after transfer via flow cytometry and immunofluorescence microscopy. This thesis contributes the following insight into the development and dynamics of the GC response: 1\. The major finding of this work was the detection of B cells bearing a GC phenotype in blood. The flow cytometric analysis revealed that these cells consist of mature B cells of a follicular GC origin. The detection of GC B cells within blood led to the postulation of the “recirculation” hypothesis, which states that a fraction of GC B cells exits the GCs and enters the peripheral blood without losing the GC B cell phenotype. Consequently, the circulation through blood enables such emigrants to enter any secondary lymphoid organ, enabling them to be re- admitted to the local GC reactions. Supposedly, such a scheme could lead to faster affinity maturation and a higher diversity of GC B cells. 2\. To test the „recirculation“ hypothesis, a blood derived GC B cell fraction was isolated and transferred into recipients which were at an early time point, just before the peak of their GC response. The obtained results showed that the blood derived GC B cells immigrate into secondary lymphoid organs and are recruited to the already existing GC reaction. Furthermore, they differentiated into plasmablasts and subsequently plasma cells. 3\. To address the question whether the capability to immigrate into secondary lymphoid organs is a GC B cell specific feature, additional transfer experiments were conducted with blood derived CD38hiIgG1+ and CD38hiIgM+ potential memory B cells, which correspond to later stages of GC B cell ontogeny. Interestingly, these two subsets displayed a different migratory behavior. Whereas CD38hiIgG1+ B cells preferentially migrated into the bone marrow and differentiated into plasma cells, CD38hiIgM+ B cells migrated into the spleen and the lymph nodes and participated in the ongoing GC reactions.

Keimzentren (GC) sind für die Entstehung des immunologischen Gedächtnisses und der Produktion hoch-affiner Antikörper von entscheidender Bedeutung. Hierbei handelt es sich um transiente Strukturen die nach Immunisierung mit einem T Zell-abhängigen Antigen in sekundär lymphatischen Geweben wie der Milz und den Lymphknoten entstehen. Im Laufe einer Immunantwort, wandern aktivierte B Zellen in die sekundär lymphatischen Organe ein und erreichen dann die T-Zell- Bereiche. Dort befinden sich für dasselbe Antigen spezifische, bereits aktivierte T-Zellen. Diese, ermöglichen den B-Zellen zu proliferieren. Ein Teil jener B-Zellen wandert zusammen mit den T-Zellen, von denen sie aktiviert wurden, zu den B-Zell-Follikeln, wo sie an der Grenze zur T-Zell-Zone Keimzentren bilden. Innerhalb der Keimzentren entstehen durch einer Reihe von mikro-evolutionären Prozessen, B-Zellen mit hoher Antigenaffinität, diese erhalten überlebenswichtige Signale von T-Zellen und können die Keimzentren verlassen um zu langlebigen Plasmazellen oder B-Gedächtniszellen zu differenzieren. Diese B-Gedächtniszellen sezernieren auch Antikörper anderer Immunglobulin-Klassen als IgM. Die Sezernierung solch „Klassengewechselter“ Antikörper ist für die Optimierung der Immunantwort von essentieller Bedeutung, da die „Immunglobulin-klasse“ eines Antikörpers bestimmend für seine Effektor-Funktion ist. Beispiele solcher Funktionen wären die Aktivierung des Komplementsystems, Opsonisierung, Neutralisation bakterieller Toxine oder Mastzellen Aktivierung. Obgleich GCs unerlässlich für die Entstehung des immunologischen Gedächtnisses sind, spielen ektopische Keimzentren, also Keimzentren die sich außerhalb des sekundären lymphatischen Gewebes bilden, in der Entstehung und dem Verlauf diverser Erkrankungen wie z.B. Rheumatischer Arthritis, Hashimoto Thyreoiditis, Sjogren Syndrom, Multipler Sklerose, HIV und chronischer Hepatitis C eine große Rolle. Aus diesem Grund ist es unabdingbar, die Dynamik und die regulierenden Mechanismen, die dem Fortbestand und der Terminierung der Keimzentren zugrundeliegen zu verstehen. Deshalb wurden folgende Untersuchungen durchgeführt: i) Es wurde eine Kinetik sämtlicher wichtigen in der GC-Reaktion involvierten B Zellen mit Hilfe von durchflusszyometrischer Methoden erstellt. Diese Analyse umfasste die drei Organe, Milz, Blut und das isolierte Knochenmark aus Femur und Tibia, und wurde an mehreren aufeinanderfolgenden Zeitpunkten nach Induktion einer primären und sekundären Immunantwort mit dem Model Antigen NP-KLH vorgenommen. ii) Um das Migrationsverhalten von GC-B -Zell-Emigranten zu untersuchen, wurden verschiedene im Blut zirkulierende zu unterschiedlichen Zeitpunkten der GC-B-Zell-Entwicklung gehörige B-Zell- Populationen isoliert und in Rezipienten transferiert die zu unterschiedlichen Zeitpunkten zuvor immunisiert waren. Die Lokalisierung und weitere Differenzierung der transferierten B-Zellen wurden in der Milz und im Knochenmark mittels Durchflusszytometrie und in den mesenterischen Lymphknoten mit Immunofluoreszenz-Mikroskopie innerhalb einer Woche nach dem Transfer bestimmt. Diese Arbeit trägt durch folgende Erkenntnisse zum Verständnis der GC Entwicklung und Dynamik bei: 1) Eines der wichtigsten Erkenntnisse dieser Arbeit war die Detektion von B-Zellen mit einem GC Phänotyp im Blut. Die durchflusszyometrischen Untersuchungen zeigten dass diese Zellen eindeutig reife B-Zellen sind und follikulären Ursprung haben. Die Entdeckung von GC-B-Zellen im Blut führte zu der Hypothese der „Rezirkulation“; die besagt das eine Fraktion von GC-B-Zellen nach Verlassen der GC ins periphere Blut wandern, ohne ihren Phänotyp zu verlieren. Das Zirkulieren dieser Zellen im Blut ermöglicht es ihnen in jedes beliebige sekundäre lymphatische Gewebe einzuwandern um dort, in den lokalen GC Reaktionen teilzunehmen. Solch ein Schema würde zu einer höheren GC-Diversität und einer schnelleren Affinitätsreifung führen. 2) Um der „Rezirkulation-Hypothese“ eine experimentelle Basis zu geben, wurden die im Blut detektierten GC-B-Zellen isoliert und in Rezipienten transferiert, die sich in der frühen Phase oder kurz vor dem Höhepunkt der GC Reaktion befanden. Die Resultate zeigten dass die transferierten GC-B-Zellen in das sekundäre lymphatische Gewebe einwandern und an laufenden GC Reaktionen teilnehmen können um dann weiter zu Plasmazellen zu differenzieren. 3) Um zu prüfen ob die Fähigkeit in sekundär lymphatisches Gewebe zu immigrieren im Laufe der GC B-Zell Entwicklung beibehalten wird, wurden zwei weitere aus dem Blut gewonnene B-Zelltypen, die in einem späteren Entwicklungsstadium der GC B-Zellontogenese waren, auf dieselbe Weise transferiert. Hierbei handelte es sich um zwei potentielle Gedächtnis-B Zellpopulationen; CD38hiIgG1+ und CD38hiIgM+ B-Zellen. Die Analysen ergaben dass diese zwei B-Zellpopulationen in der Tat ein unterschiedliches Migrationsverhalten aufweisen. Während die IgG1+ B-Zellen bevorzugt in das Knochenmark einwanderten und zu Plasmazellen differenzierten, immigrierten die IgM+ B-Zellen auch in die Milz und die Lymphknoten wo sie teilweise an der laufenden GC Reaktion des Rezipienten teilnahmen.