Digene Hypertonie: Blutdruckregulation an wachen Mäusen mit Überaktivierung des Epithelialen Natriumkanals (Liddle-Mutante) und genetischer Inaktivierung der β1-Untereinheit des Ca (hoch 2+)-aktivierten Kaliumkanals.

Abstract

Der chronisch erhöhte Blutdruck gehört zu den häufigsten pathologischen Befunden in der westlichen Welt und stellt aufgrund seiner Bedeutung für kardiovaskulär bedingte Erkrankungen ein gravierendes Problem dar. Bei der essentiellen arteriellen Hypertonie handelt es sich um ein multifaktoriell bedingtes Krankheitsbild, dem nach derzeitigem Kenntnisstand sowohl Umweltfaktoren, als auch genetische Determinanten zugrunde liegen. Im Gegensatz zu den wenigen monogenetisch bedingten Hypertonieformen sind die Effekte der einzelnen beteiligten Gene gering, und erst eine Interaktion von multiplen Genen mit blutdruckregulierenden Eigenschaften führt zu einer Manifestation der Erkrankung. Durch die Anwendung genetischer Methoden haben sich für die Analyse von Faktoren, die an der Entstehung einer Hypertonie beteiligt sind, zahlreiche neue Perspektiven eröffnet. Um einen tieferen Einblick in die Ätiologie der essentiellen Hypertonie zu gewinnen, ist es von großem Interesse, wie sich wichtige Systeme für die Blutdruckregulation bei der Entstehung von Hypertonien beeinflussen. Monogenetisch verursachte Krankheiten stellen eine einzigartige Möglichkeit dar, um den Zusammenhang zwischen Umwelteinflüssen, wie z.B. Kochsalzabusus, und genetischen Faktoren untersuchen zu können. Eine dieser monogenetischen Erkrankungen ist das Liddle`s Syndrom, das zu einer Fehlregulation des ENaC führt und deren Folge eine salzsensitive Hypertonie ist. Mäuse mit einer homozygot vorliegenden genetischen Deaktivierung der β1-Untereinheit des Ca (hoch 2+)-aktivierten Kaliumkanals (BK β1 d/d) weisen einen signifikant erhöhten mittleren arteriellen Blutdruck auf. Außerdem zeigen die BK β1-KO Mäuse einen erhöhten arteriellen Tonus in isolierten Gefäßen. Auf der Basis dieser Beobachtungen wurde geschlussfolgert, dass die arterielle Hypertonie bei BK β1- KO Mäusen eine direkte Konsequenz des erhöhten myogenen Tonus in arteriellen Widerstandsgefäßenen ist. Da die BK β1-KO Mäuse aber außerdem signifikant erhöhte Plasmaaldosteronkonzentrationen aufweisen, deren Ursache noch nicht hinlänglich geklärt ist, geht man zur Zeit davon aus, dass der Hypertonus zu einem großen Teil durch den erhöhten Plasmaaldosteronspiegel hervorgerufen wird. Das in dieser Arbeit untersuchte Mausmodell ist eine durch Kreuzung von Mäusen mit genetischer Inaktivierung der β1-Untereinheit des Ca(hoch2+)-abhängigen Kaliumkanals (BK β1 d/d) und Mäusen, bei denen durch genetische Manipulation eine Überaktivierung (gain of function) des ENaC induziert wurde (L/L), entstandene Doppelmutante. Es beruht damit auf zwei genetischen Defekten, die jeder für sich in homozygoter Ausprägung ein Modell für eine arterielle Hypertonie darstellen und phänotypisch einen Hyperaldosteronismus bzw. Pseudohyperaldosteronismus aufweisen, der durch unterschiedliche Mechanismen induziert wird. Sowohl das RAAS, als auch die renale Salz- und Wasserhomöostase werden durch die genetischen Veränderungen beeinflusst. Die einzelnen genetischen Veränderungen verursachen bei heterozygotem Auftreten im Tiermodell unter physiologischen Haltungsbedingungen keinen Bluthochdruck. Vor diesem Hintergrund war das Ziel dieser Arbeit zu klären, ob bei gleichzeitigem Auftreten der Mutationen im heterozygoten Genotyp durch Interaktionen im Phänotyp eine Hypertonie verursacht wird und die Blutdruckregulation Unterschiede aufweist. Durch die Bestimmung der Plasmakonzentrationen von Aldosteron und der wichtigsten Elektrolyte sollten Anhaltspunkte über die Aktivität des RAAS und über pathophysiologische Veränderungen der Salz- und Wasserhomöostase gewonnen werden. Schließlich wurde der Einfluss einer unterschiedlichen Salzbelastung auf den Phänotyp der doppelheterozygoten Mausmutante untersucht. Hierzu wurden in vier Versuchsserien an adulten männlichen doppelheterozygoten Mausmutanten (+/L +/d), dem entsprechenden Wildtyp (+/+ +/+), sowie teilweise an einzelheterozygyoten Mäusen (+/L +/+ und +/+ +/d) die folgenden Untersuchungen durchgeführt: 1\. Messung des mittleren arteriellen Blutdrucks und der Herzfrequenz an wachen und ungestressten Mäusen über einen chronischen arteriellen Katheter am 2. und 3. Postoperativen Tag. 2\. Entnahme von Blutproben über den arteriellen Katheter mit anschließender Bestimmung der Plasmakonzentration von Aldosteron, Elektrolyten und Kreatinin. 3\. Entnahme der Herzen mit Bestimmung des Herzgewichts sowie des Gewichts des linken und rechten Ventrikels. Anschließende Berechnung des Verhältnisses von Herzgewicht bzw. Gewicht des linken Ventrikels zum Körpergewicht als Index einer myokardialen Hypertrophie. 4\. Entnahme der Nieren mit Bestimmung des Gesamtnierengewichts. Anschließende Berechnung der Verhältnisses vom Gesamtnierengewicht zum Körpergewicht. 5\. Messung der hämodynamischen Parameter (MAD, Systole, Diastole), der Herzfrequenz und der Aktivität mittels radiotelemetrischen Messverfahrens; a Auswertung der Mittelwerte b Auswertung des Zirkadianen Rhythmus c Auswertung der unterschiedlichen Salzbelastung 6\. Stoffwechselbilanzierung im metabolischen Käfig unter unterschiedlicher Salzbelastung Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen sich wie folgt zusammenfassen: 1\. Die doppelheterozygoten Mäuse (+/L +/d) wiesen gegenüber den heterozygoten BK β1-KO-Mäusen (+/+ +/d) einen signifikant erhöhten MAD auf. 2\. Die Befunde der morphometrischen Untersuchungen ergaben ein erhöhtes relatives linksventrikuläres Herzgewicht der doppelheterozygoten Tiere (+/L +/d) gegenüber den Wildtypen (+/+ +/+). 3\. Die Plasmaaldosteronkonzentration der doppelheterozygoten Mäuse (+/L +/d) und der heterozygoten Liddle-Mäuse (+/L +/+) war gegenüber den Wildtypen (+/+ +/+) und den heterozygoten BK β1 -KO-Mäusen (+/+ +/d) signifikant erniedrigt. Ebenso war der Plasmaaldosteronspiegel der heterozygoten BK β1-KO-Mäuse (+/+ +/d) gegenüber den Wildtypen (+/+ +/+) tendenziell erhöht. 4\. Die Plasmakonzentrationen von Na(hoch+), K(hoch+) und Cl(hoch)- der doppelheteroygoten Mäuse (+/L +/d) unterschieden sich nicht von denen der Wildtyp Mäuse (+/+ +/+). Der Plasmaspiegel des Kreatinin lag dagegen bei den doppelheterozygoten Mäusen (+/L +/d) signifikant über dem der Wildtyp Mäuse (+/+ +/+). 5\. Die doppelheterozygoten Mäuse (+/L +/d) zeigten während der radiotelemetrischen Blutdruckmessung einen ihrer Spezies entsprechenden zirkadianen Rhythmus. 6\. Sowohl die hämodynamischen Parameter als auch die Aktivität der doppelheterozygoten Mäuse (+/L +/d) sind während der nächtlichen Aktivitätsphase signifikant höher als die der Wildtyp Mäuse (+/+ +/+). 7\. Unter der salzarmen Diät während der radiotelemetrischen Blutdruckmessung ergab ein direkter Vergleich der Tagesmittelwerte, dass der MAD der doppelheterozygoten Mäuse (+/L +/d) signifikant über dem der Wildtypen (+/+ +/+) lag. 8\. Sowohl die Werte der Herzfrequenz als auch die der Aktivität der doppelheterozygoten Mäuse (+/L +/d) während der radiotelemetrischen Blutdruckmessung lagen bei einem direkten Vergleich der Tagesmittelwerte unter allen Diäten signifikant über den Werten der Wildtypen (+/+ +/+). 9\. Die Umstellung der Salzbelastung hatte keinen signifikanten Einfluss auf die hämodynamischen Parameter beider Versuchsgruppen. 10\. Die Versuche im metabolischen Käfig konnten keine eindeutigen Ergebnisse hinsichtlich der Ein- und Ausfuhrbilanzierung liefern. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit kein deutlich ausgeprägter Gen-Dosis- Effekt nachgewiesen werden. Dennoch scheint die Kombination der beiden genetischen Defekte in heterozygoter Ausprägung einen milden Effekt auf die Blutdruckregulation auszuüben.

Chronic high blood pressure is one of the most common diagnostic findings in the western world and poses a serious health problem due to its association with cardiovascular diseases. Essential arterial hypertonia is a multifactorially caused disease that to present knowledge is both linked to environmental factors and genetic determinants. Compared to the few monogenetically caused hypertonia forms, the effects of individual genes on the manifestation of hypertonia are minor. Only an interaction of multiple genes responsible for blood pressure adjustments leads to a manifestation of the disease. With the use of genetic methods numerous new perspectives have evolved for the analysis of factors associated with hypertonia. For a better understanding of essential hypertonia etiology, it is of large interest to comprehend the interaction of essential systems for blood pressure regularization. Monogenetically caused diseases provide an outstanding possibility to examine the interdependence of environmental influences, e.g. the extensive use of sodium, and genetic factors. One of these monogenetic illnesses is the Liddle syndrome that leads to an abnormal regularization of the ENaC and thus sodium sensitive hypertonia. Mice with a homozygous genetic deactivation of the β1 subunit of the Ca(2+squared)-activated potassium channel (BK β1 d/d) have a significantly increased mean arterial blood pressure. In addition, the BK β1-KO mice display an increased arterial tonus in isolated vessels. Based on these observations the conclusion was drawn that arterial hypertension in BK β1-KO mice directly results from the increased myogenic tonus in the arterial resistance vessels. However, the BK β1-KO mice also have a significantly increased plasma aldosterone concentration that researchers were not fully able to explain yet. It is currently assumed that the hypertension in BK β1-KO mice is to a large extent caused by the increased aldosterone concentration. The examined mouse model in this study is a double mutant caused by a crossing of mice with a genetic inactivation of the Ca(2+squared)-dependent potassium channel (BK β1 d/d) and with genetically manipulated mice with an over-activation (“gain of function") of the ENaC (L/L). Therefore, this mice model is based on two genetic defects which each in itself - if expressed homozygous - resembles a model for arterial hypertension. This model phenotypically induces a hyperaldosteronism or pseudohyperaldosteronism, respectively, caused by different mechanisms. Both the RAAS as the renal salt and water homeostasis are affected by genetic changes. Yet, individual heterozygous genetic changes do not cause high blood pressure (animal model under physiological conditions). The aim of this study was to investigate whether the simultaneous occurrence of mutations in a heterozygous genotype results in hypertension due to subsequent phenotype interactions. Furthermore, it should be investigated, whether this simultaneous occurrence leads to differences in blood pressure regulation. By determining plasma concentrations of aldosterone and other important electrolytes should be gained information on the activity of RAAS-related and pathophysiological changes in salt and water homeostasis. Finally, it should be investigated the influence of different salt exposures on the phenotype of the double heterozygous mutant mouse. For this purpose, in four experiments series the following tests were performed on an adult male double heterozygous mutant mice (+/L +/d), the corresponding wild-type (+/+ +/+), and a single heterozygous mice (+/L +/+ and +/+ +/d): 1\. Measurement of the mean arterial blood pressure and heart rate in awake and unstressed mice using a chronic arterial catheter on the second and third postoperative day. 2\. Blood sampling via the arterial catheter followed by measurement of plasma concentration of aldosterone, electrolytes and creatinine. 3\. Heart removal with determination of heart weight and the weight of the left and right ventricle. Ratio calculation of total heart weight or left ventricel weight, respectively, to body weight as an index of myocardial hypertrophy. 4\. Removal of the kidneys with the determination of total kidney weight. Subsequent ratio calculation of total kidney weight to body weight. 5\. Measurement of hemodynamic parameters (mean arterial blood pressure, systole, diastole), heart rate and activity by radiotelemetric measurement method: a Evaluation of the mean values. b Evaluation of the circadian rhythm. c Evaluation of the different salt concentrations. 6\. Metabolism analysis in the metabolic cage under different salt exposures. The results can be summarized as the following: 1\. The double heterozygous mice (+/L +/d) showed a significant increase in mean arterial blood pressure compared to the BK β1-heterozygous knockout mice (+/+ +/d). 2\. The findings of the morphometric studies showed an increased relative weight of the left ventricular heart in double heterozygous animals (+/L +/d) compared to the wild type (+/+ +/+). 3\. The plasma aldosterone concentration of double heterozygous mice (+ / L + / d) and the heterozygous Liddle mice (+/L +/+) were significantly lower compared to the wild type (+/+ +/+) and the heterozygous BK_1-KO mice (+/+ +/d). Likewise, the plasma concentrations of aldosterone of the heterozygous BK β1-KO mice (+/+ +/d) tended to be higher compared to the wild type (+/+ +/+). 4\. The plasma concentrations of Na(+squared), K(+squared) and Cl(-squared) of double heterozygous mice (+/L +/d) did not differ from those of wild-type mice (+/+ +/+). The plasma creatinine levels of the double heterozygous mice (+/L +/d) were significantly higher than those of wild-type mice (+/+ +/+). 5\. The double heterozygous mice (+/L +/d) showed a (for their species) typical circadian rhythm in the radiotelemetric blood pressure measurement. 6\. Both the hemodynamic parameters and the activity of double heterozygous mice (+/L+/d) were significantly higher during the nocturnal activity phase than of the wild-type mice (+/+ +/+). 7\. Given a low-salt diet in direct comparison of the daily average values , the mean arterial blood pressure was significantly higher for double heterozygous mice (+/L +/d) than for the wild type (+/++/+) in the radiotelemetric blood pressure measurements. 8\. In direct comparison of the daily average values of all diets in the radiotelemetric blood pressure measurement, both the values of heart rate and the activity were significantly higher for the double heterozygous mice (+/L+/d) than for the wild type (+/+ +/+). 9\. Conversion of the salt load had no significant influence on hemodynamic parameters of the two experimental groups. 10\. The experiments in the metabolic cage could not provide clear results in terms of influx and elimination balance analysis. In conclusion, in this thesis no explicit gene-dose effect could be detected. Nevertheless,the combination of the two genetic defects in heterozygous expression seems to have a mild effect on blood pressure regulation.