Funktionelle und molekularbiologische Untersuchungen zur Beteiligung von zwei TRP Kanälen an der Leitfähigkeit des Pansenepithels für Ammonium, Natrium, Kalium und Calcium

Abstract

Die Rinderhaltung trägt wesentlich zur Emission von umwelt- und klimarelevanten Stickstoffverbindungen bei. Diese basieren hauptsächlich auf der renalen Ausscheidung überschüssigen Stickstoffs in Form von Harnstoff. Zu einem erheblichen Anteil entstammt dieser der Fermentation von verfütterten Proteinen im Pansen, welche von der ruminalen Stickstoff-Resorption in Form von NH4+ gefolgt ist. Funktionelle Voruntersuchungen wiesen auf einen nicht-selektiven Kationenkanal als Aufnahmemechanismus hin. Ferner ist seit vielen Jahren klar, dass die ruminale Aufnahme von Ca2+ über einen Vitamin D unabhängigen und zumindest teilweise elektrogenen Mechanismus erfolgt. Eine Identifikation der verantwortlichen Transportproteine erscheint zwingend, um neue Strategien u.a. zur Vermeidung der Gebärparese beim Wiederkäuer zu entwickeln. Die bereits erfolgte Detektion der mRNA für verschiedene TRP Kanäle im bovinen Pansenepithel und funktionelle Voruntersuchungen legten eine Beteiligung des bTRPV3 am ruminalen Kationentransport nahe. Hingegen war für die ebenfalls detektierte mRNA für bTRPV4 noch keine Funktion für diesen Kanal vorgeschlagen worden. Um zu klären, ob es sich überhaupt um epitheliale Transportproteine handelt oder um neuronale Kanäle, war eine Lokalisation im Pansengewebe notwendig. Im Rahmen dieser Dissertation wurden daher die bovinen Homologe von bTRPV3 und bTRPV4 sequenziert. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden die beiden Kanäle jeweils in HEK-293 Zellen und bTRPV3 zusätzlich in Xenopus laevis Oozyten überexprimiert. Die Eignung von spezifischen Antikörpern zur Detektion dieser bovinen Proteine konnte damit bestätigt und die Funktion der Kanäle gezielt untersucht werden. Mithilfe der so etablierten Antikörper konnten bTRPV3 und bTRPV4 im Pansenepithel per Immunoblot nachgewiesen und per Immunfluoreszenz lokalisiert werden, wobei die intensive, apikale Detektion beider im Stratum granulosum eine Beteiligung am Transportgeschehen nahelegt. Diese Schlussfolgerung wurde durch Ussing Kammer Untersuchungen mithilfe von bTRPV3 bzw. bTRPV4 Agonisten am ruminalen Epithel unterstützt. In elektrophysiologischen Untersuchungen an HEK-293 Zellen wurden die Agonisten ebenfalls erprobt. Nur an bTRPV4 und nicht an bTRPV3 HEK-293 Zellen wirkte GSK1016790A stimulierend. Am nativen Pansenepithel waren allerdings deutlich höhere Konzentrationen nötig gewesen, um Effekte zu erzielen. An bTRPV3 HEK-293 Zellen konnte der 2-APB Effekt aus dem Ussing Kammer Versuch reproduziert werden. Schließlich wurde die Leitfähigkeit von bTRPV3 und von bTRPV4 für NH4+, K+, Na+ und Ca2+ nach Überexpression demonstriert. Im Falle von bTRPV3 kamen drei Untersuchungsmethoden (Calcium-Imaging, pH-sensitive Mikroelektroden und Patch-Clamp in whole-cell und inside-out Konfiguration) zum Einsatz, während bei bTRPV4 HEK-293 Zellen das Calcium-Imaging und die Patch-Clamp in whole-cell Konfiguration genutzt wurden. Die Stimulation des bTRPV3 durch Menthol oder Natriumbutyrat bewirkte einen Ca2+-Einstrom. Der Effekt dieser kurzkettigen Fettsäure auf bTRPV3 dürfte auf eine intrazelluläre H+-bedingte Aktivierung beruhen. Eine Natriumbutyrat Stimulation konnte für bTRPV4 im Calcium-Imaging aber nicht in der Patch-Clamp gezeigt werden, was für eine Aktivierung durch eine Zunahme des Zellvolumens spricht. Interessanterweise wurde bei inside-out Patch-Clamp und pH-sensitiven Mikroelektroden Messungen gezeigt, dass auch Kontroll-Xenopus laevis Oozyten endogene Kationenkanäle exprimieren, allerdings wiesen diese für NH4+ eine geringere Leitfähigkeit auf. Außerdem wurde erneut die Membran von Xenopus laevis Oozyten als weitgehend undurchlässig für NH3 befunden. Nach Charakterisierung an Überexpressionssystemen, funktionellen Untersuchungen am Pansenepithel, molekularbiologischen Untersuchungen mit Immunoblot und Lokalisation im Epithel erscheint insbesondere bTRPV3 für die apikale Aufnahme von Ca2+ und NH4+ im Pansen verantwortlich. Die bTRPV4 Beteiligung an diesem apikalen Transportgeschehen dürfte vermutlich erst bei Zellschwellung zunehmen. Damit konnte die molekulare Identität zweier Proteine mit Bedeutung für die NH4+-Resorption im ruminohepatischen Kreislauf geklärt werden. Beide dürften auch für die ruminale Ca2+ Resorption relevant sein. Vielfältige Möglichkeiten der Modulation durch pflanzliche Wirkstoffe eröffnen sich für Fütterungsstrategien und therapeutische Intervention am Wiederkäuer.

Cattle farming contributes greatly to the emission of nitrogenous compounds with a negative impact on the environment and the global climate. The main source of these compounds is the renal excretion of excess nitrogen in the form of urea. Most of this nitrogen is generated from the fermentative degradation of feed protein with subsequent absorption in the form of NH4+ across the wall of the rumen. Previous functional studies suggested a non-selective cation channel for this uptake mechanism. Furthermore, it has been clear for many years that the ruminal uptake of Ca2+ involves a Vitamin D independent pathway that is at least partially electrogenic. An identification of the responsible proteins appears mandatory in order to develop strategies for the avoidance of parturient paresis and other pathologies associated with calcium deficiency in the ruminant. Previous detection of mRNA for various TRP channels in the bovine ruminal epithelium and functional investigations supported a participation of bTRPV3 in ruminal cation transport. However, no functional role for the bTRPV4 channel had been proposed for the detected bTRPV4 mRNA. In order to clarify whether bTRPV3 and bTRPV4 are epithelial transport proteins or neuronal channels, a localisation in ruminal epithelium was necessary. In the current thesis, the coding sequences of the bovine homologues bTRPV3 and bTRPV4 were determined. Based on these results, both channels were overexpressed in HEK-293 cells, while bTRPV3 was additionally overexpressed in Xenopus laevis oocytes. This made it possible to confirm the suitability of specific antibodies for detection of the bovine proteins and to investigate the function of these channels in a stringent manner. Using established antibodies, it was possible to detect and localize bTRPV3 and bTRPV4 in the ruminal epithelium via immunoblot and immunofluorescence staining, respectively. The intense apical staining pattern in the stratum granulosum supported an involvement in epithelial transport. This conclusion was supported by Ussing chamber measurements on the ruminal epithelium using bTRPV3 and bTRPV4 agonists, respectively. Additionally, these agonists were tested in patch-clamp measurements on HEK-293 cells. While GSK1016790A strongly stimulated bTRPV4 HEK-293 cells, it showed no effect on bTRPV3. However, much higher concentrations were required to see effects on native ruminal epithelia. The stimulatory effects of 2-APB on bTRPV3 HEK-293 cells were comparable to those in Ussing chamber experiments. Finally, the conductance of bTRPV3 and bTRPV4 for NH4+, K+, Na+ und Ca2+ was demonstrated in overexpressing systems. In the case of bTRPV3, three different measuring techniques (calcium imaging, pH-sensitive microelectrodes and patch-clamp in whole-cell and inside-out configuration) were used. The bTRPV4 HEK-293 cells were investigated using calcium imaging and patch-clamp in the whole-cell configuration. Menthol and sodium butyrate both enhanced the bTRPV3-dependent uptake of Ca2+. Influx of this short-chain fatty acid most likely activated bTRPV3 via cytosolic protons. In calcium-imaging but not in patch-clamp experiments, sodium butyrate enhanced uptake via bTRPV4. The effect on bTRPV4 was probably caused by an increase in cellular volume. Interestingly, it was possible to show in inside-out patch-clamp and experiments with pH-sensitive microelectrodes that control Xenopus laevis oocytes also expressed endogenous cation channels with a much smaller conductance for the NH4+. As shown in previous investigations, the membrane of Xenopus laevis oocytes appeared to be largely impermeable to NH3. After characterization in overexpressing systems, functional experiments on native epithelia and protein detection and localisation, it appears highly probable that particularly bTRPV3 is involved in the apical uptake of Ca2+ and NH4+ by the rumen. The role of bTRPV4 in apical uptake should increase with cellular swelling. Thus, it was possible to identify the molecular identity of two proteins with relevance for NH4+ uptake in rumino-hepatic nitrogen recirculation. Both should also be relevant for Ca2+ uptake by the rumen. In light of these findings, the modulation of uptake by numerous plant-derived compounds appears possible with repercussions for new strategies in feeding and therapeutic intervention in the ruminant.