Spectroscopic Investigation of Novel Optogenetic Tools

Abstract

Optogenetics is a fairly young scientific field that uses the expression of light-sensitive proteins in particular cell types, referred to as optogenetic tools, to modulate their response by light. In this work two different optogenetic tools were investigated. The transmembrane protein KcsA was converted to an artificial light-gated ion channel by an azobenzene photoswitch that carried a tetraethyl ammonium group blocking the ion flow. Interactions of KcsA with different types of photoswitches were investigated by thermophoresis, surface-enhanced infrared spectroscopy (SEIRAS), and impedance spectroscopy. Microscale thermophoresis (MST) indicated low affinity of KcsA to the majority of probed photoswitches. Thus, a maleimide-labeled azobenzene (MAQ) was bound covalently to the P55C variant of KcsA. SEIRAS indicated the successful establishment of a tethered KcsA P55C monolayer reconstituted into lipids. However, impedance spectroscopy did not confirmed the closing and opening of the KcsA channel mediated by the MAQ, although vibrational changes where detected in the SEIRA spectrum. Thus, fast degeneration of the maleimide group probably prevented the reaction with the cysteine of the KcsA and did not lead to a functional artificial system. In the second part of this work, the mechanisms of signal transduction of blue- light photoreceptors containing LOV domains were investigated. Aureochrome 1 fromVaucheria frigida acts as a blue-light activated transcription factor, while mPAC from Microcoleus chthonoplastes is a light activated adenylyl cyclase (AC). The kinetics of the photocycle intermediates LOV715, which is a red-shifted triplet state, and the blue-shifted signaling state LOV390 were determined by time-resolved UV/Vis spectroscopy. In case of aureochrome1 the presence of the bZIP domain was found to prolong the lifetime of the LOV390 signaling state as compared to the isolated LOV domain, while the binding of DNA did not influence the photocycle kinetics. For mPAC, lifetime of the triplet state was significantly shorter than all other reported LOV domains, while the decay of the adduct state was in the normal range. The light-dark FTIR difference spectra indicated characteristic features of the flavin mononucleotide (FMN) chromophore. Furthermore, the S-H stretching vibration of the reactive cysteines involved in formation of the thio-adduct state have been detected. For aureochrome 1 the frequency was shifted to lower wavenumbers, while in mPAC this band was asymmetric, suggesting the presence of rotational isomers. Furthermore, mPAC showed a negative band that was attributed to an O-H stretch vibration of an amino acid side chain of the adenylyl cyclase domain, which is probably involved in dimerization of this domain. The light-induced FTIR difference spectrum of aureochrome 1 in presence of its target DNA contained vibrations that were assigned to lysine, arginine and phosphate-backbone groups. Thus, a model of the binding complex was determined that shows the critical interactions between the transcription factor and the DNA molecule.

In der Optogenetik werden Licht-sensitive Proteine in bestimmten Zellen exprimiert, um diese mit Hilfe von Licht zu manipulieren und zu untersuchen. Diese Proteine werden optogenetische Werkzeuge (``optogenetic tools´´) genannt. In dieser Arbeit wurden diese Werkzeuge studiert. Der membranständige KcsA-Kanal wurde mit Hilfe eines Azobenzen-basierten Photoschalters in einen künstlichen Licht-sensitiven Ionenkanal verwandelt. Dabei wird der Ionenfluss durch eine Tetraethyl Ammoniumgruppe am Photoschalter geblockt. Die Interaktionen vom KcsA mit verschiedenen Photoschalter-Molekülen wurde mittels Thermophorese, oberflächenverstärkter Infrarot Spektroskopie (SEIRAS) und Impedanz Spektroskopie untersucht. Die Thermophoresemessungen ergaben dabei für die meisten Photoschalter eine geringe Affinität zum KcsA. Deshalb wurde in einem zweiten Ansatz mit MAQ ein alternatives Azobenzene Konjugat an die KcsA P55C Variante gebunden. MAQ enthält eine Maleimid-Gruppe, die eine kovalente Bindung mit dem Thiol des neueingeführten Cysteins eingeht. Im SEIRA Differenzspektrum wurden zwar Banden des Photoschalters detektiert, jedoch konnte durch Impedanz Spektroskopie das Öffnen und Blockieren des Kanals durch den Photoschalter in der Monolage aus Lipiden nicht nachgewiesen werden. Dies begründet sich wahrscheinlich in der schnellen Degeneration der Maleimidgruppe des MAQ wodurch eine Reaktion mit dem Cystein nicht mehr möglich ist. Im zweiten Teil wurde die Signaltransduktion von Blaulichtrezeptoren, die eine LOV Domäne enthalten, untersucht. Aureochrome 1 aus Vaucheria frigida ist ein Blaulicht aktivierter Transkriptionsfaktor, während mPAC aus Microcoleus chthonoplastes als Licht-aktivierte Adenylyl Cyclase (AC) fungiert. Die Kinetiken der Photozyklus Intermediate LOV715, welches einen rotverschobenen Triplett Zustand darstellt, und des blauverschobene Signalzustandes LOV390 wurden mittels Blitzlichtphotolyse bestimmt. Für Aureochrome 1 wurde gezeigt, dass die bZIP-Domäne die Lebenszeit des Signalzustandes verlängert, während die Bindung an die Ziel-DNA keinen Einfluss auf die Photozyklus-Kinetik hat. Für mPAC lag der Zerfall des Addukt Zustandes im normalen Bereich, jedoch war die Lebenszeit des Triplett Zustandes im Vergleich zu allen bekannten LOV- Proteinen um den Faktor 3 verkürzt. Licht-Dunkel FT-IR Differenzspektren zeigten für Aureochrome 1 und mPAC die charakteristischen Banden des Flavin Mononukleotid (FMN) Chromophores. Außerdem konnten die S-H Streckschwingungen der reaktiven Cysteine detektiert werden, die im Addukt Zustand eine kovalente Bindung mit dem FMN eingehen. Für Aureochrome 1 war die Frequenz dieser Bande zu niedrigeren Wellenzahlen verschoben, während sie in mPAC asymmetrisch war. Dies ist auf die Präsenz von Rotationsisomeren des Cysteins zurückzuführen. Des Weiteren wurde im mPAC Spektrum eine charakteristische, negative Bande detektiert, die der O-H Streckschwingung einer alkoholischen Seitenkette der Adenylylcyclase Domäne zugeordnet werden kann. Dabei handelt es sich wahrscheinlich um ein Threonin oder Serin, das an der Dimerisierung dieser Domäne beteiligt ist. Das Licht-Dunkel FT-IR Differenzspektrum von Aureochrome 1 in Anwesenheit der Ziel-DNA enthielt für Lysin und Arginin, wie auch für das Phosphat-Rückgrat charakteristische Banden. Somit konnte ein Modell des Bindungskomplex erstellt werden, das die kritischen Interaktionen zwischen dem Transkriptionsfaktor und der DNA zeigt.