Analyse purinerger Stoffwechselwege und NAD+-Konzentration in Patienten mit hepatozellulärem Karzinom nach Leberresektion und Lebertransplantation

Abstract

Background: In Germany, one in 88 men and one in 190 women develop hepatocellular carcinoma (HCC) during lifetime. Improved curative therapies and new multimodal treatment strategies have nowadays increased survival rates upon liver resection or transplantation. Since the most important factor in the process of malignant transformation of HCC is the patient’s individual immune system, a deep understanding of the underlying immunological mechanisms is essential for further refinement of diagnosis and therapy. This study focuses on purinergic signaling mechanisms mediated by ectoenzymes of T-cells and monocytes as well as determination of NAD+ in blood plasma. The aim of this work is to identify potential biomarkers and assess their suitability for diagnosis and prognosis of HCC. Methods: In this exploratory study, 31 HCC patients whose therapy included either liver transplantation (n=11) or resection (n=20) were included and compared to a control group (n=10). At previously defined time points, pre-, and postoperatively as well as during acute rejection (ACR) or ischemic reperfusion injury (IRI), mononuclear cells were isolated from blood samples and cryopreserved together with blood plasma. The NAD+ concentration of the blood plasma was determined by heat-based dichotomous pH extraction procedure. Flow cytometry was used to assess the patients' monocyte and T-cell populations which had been extracted and cultivated from the samples, thereby emphasizing the analysis of ectoenzymes, purinergic receptors and cytokines. Results: Lower NAD+ concentration was detected both, pre- and postoperatively in patients with liver resections. In this group, we found several subtypes of T-cells expressing ectoenzymes and other regulators of purinergic metabolism (CD38, CD203a and Cx43) to be depleted, while a higher proportion of TIE-2-expressing monocytes (TEMs) expressed the ectoenzyme CD39. A higher proportion of CD163 expressing TEMs and CD14+ CD16+ monocytes were associated with shorter recurrence-free and overall survival. The Expression of Ectoenzymes on Th17-cells was preoperatively upregulated in transplant patients with IRI. Patients with ACR showed preoperatively decreased proportions of CD39-expressing monocytes and TEMs. Discussion: The purinergic signaling system has a significant impact on solid tumor growth, survival, and progression by influencing not only the tumor itself but also immune responses and the associated tumor microenvironment. By establishing the studied ectoenzymes as new potential biomarkers, improvement of diagnosis, prognosis, treatment options and decisions in HCC appears promising. Larger cohort studies are needed to validate the herein proposed ectoenzymes on T-cells and monocytes as well as blood NAD+ levels as biomarkers for the diagnosis and prognosis of HCC.

Hintergrund: In Deutschland entwickelt einer von 88 Männern und eine von 190 Frauen im Laufe ihres Lebens ein hepatozelluläres Karzinom (HCC). Durch verbesserte kurative Therapien und neue multimodale Behandlungsstrategien haben Patienten nach Leberresektion oder - transplantation heutzutage erhöhte Überlebensraten. Da der wichtigste Faktor im Prozess der malignen Transformation des HCC das Immunsystem des Betroffenen selbst darstellt, ist ein ausgeprägtes Verständnis der zugrunde liegenden immunologischen Mechanismen für die Weiterentwicklung von Therapie und Diagnostik unabdingbar. In dieser Studie stehen durch Ektoenzyme der T-Zellen und Monozyten vermittelte purinerge Signalmechanismen sowie NAD+ - Konzentrationen im Blutplasma im Mittelpunkt. Ziel dieser Arbeit ist es, potenzielle Biomarker zu identifizieren und deren Eignung für Diagnostik und Prognose des HCC zu prüfen. Methodik: In dieser explorativen Studie wurden 31 HCC-Patienten eingeschlossen, deren Therapie eine Lebertransplantation (n=11) bzw. -resektion (n=20) umfasste, und mit einer Kontrollgruppe (n=10) verglichen. An zuvor definierten Zeitpunkten, prä- und postoperativ sowie bei akuter Abstoßungsreaktion (ACR) oder ischämischen Reperfusionsschaden (IRI), wurden mononukleäre Zellen aus Blutproben isoliert und einschließlich des Blutplasmas kryokonserviert. Die NAD+ - Konzentration im Blutplasma wurde per hitze-basiertem dichotomen pH-Extraktionsverfahren ermittelt. Mittels Durchflusszytometrie wurden die Monozyten der Patienten als auch aus den Proben gewonnene und kultivierte T-Zellen analysiert. Ein Schwerpunkt bildete dabei die Bestimmung von Ektoenzymen, purinergen Rezeptoren und Zytokinen. Ergebnisse: Bei Patienten mit Leberresektion konnte sowohl prä- als auch postoperativ eine niedrigere NAD+ -Konzentration nachgewiesen werden. Verschiedene durch Expression von Ektoenzymen und weiteren Regulatoren des purinergen Stoffwechsels (CD38, CD203a, Cx43) charakterisierte T-Zell-Subpopulationen waren in dieser Patientengruppe deutlich verringert, wohingegen ein höherer Anteil an TIE-2-exprimierenden Monozyten (TEMs) das Ektoenzym CD39 exprimierten. Patienten mit hohem Anteil an CD163 exprimierenden TEMs und CD14+ CD16+ Monozyten wiesen ein erheblich verkürztes rezidivfreies - und Gesamtüberleben auf. Auch Transplantationspatienten mit einem IRI zeigten präoperativ eine Erhöhung der Expression der Ektoenzyme auf Th17-Zellen. Dagegen wiesen Patienten mit ACR präoperativ verringerte Anteile an CD39 exprimierenden Monozyten und TEMs auf. Diskussion: Das purinerge Signalsystem hat erhebliche Auswirkungen auf Wachstum, Überleben und Progression solider Tumore, indem es nicht nur den Tumor selbst, sondern auch die Immunreaktionen und die mit ihm verbundene Tumormikroumgebung beeinflusst. Durch die Verwendung der in dieser Studie untersuchten Ektoenzyme als neue potenzieller Biomarker erscheint eine Verbesserung von Diagnose, Prognose, Therapieoptionen und -entscheidungen bei HCC-Patienten vielversprechend. Größere Kohortenstudien sind nötig, um die hier nachgewiesene Eignung der Ektoenzyme auf T-Zellen und Monozyten als auch die NAD+ -Konzentration im Blut als Biomarker für die Diagnose und Prognose des HCC zu validieren.