Neue Antithrombotika mit Imidazolpartialstruktur

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es in Anlehnung an den sGC-Aktivator YC-1 und die Substanz A, [2-n-Butyl-5-chlor-1-(2-chlorphenylmethyl)-1H-imidazol-4-yl ]-essigsäure-methyl-ester, neue Verbindungen mit antiaggregatorischen (in vitro) und antithrombotischen Eigenschaften (in vivo) zu synthetisieren. Substanz A beeinflußt den cGMP-Metabolismus durch die Inhibition der cGMP- spezifischen Phosphodiesterase (PDE 5). So wurden 1-, 2-, 5-substituierte 1H- Imidazol-4-carbonsäurederivate hergestellt. Die Produkte wurden mit der Elementaranalyse, den Methoden 1H-NMR- und IR- sowie mit Massenspektroskopie charakterisiert. Danach wurden die Verbindungen im Born-Test (in vitro) auf ihre antiaggregatorischen Effekte untersucht. Kollagen wurde eingesetzt, um die Thrombozytenaggregation im Plättchenreichen Plasma (PRP) zu induzieren.Wegen der schlechten Löslichkeit wurde die Inkubationszeit von vier Minuten auf zwanzig Minuten verlängert. Die erhöhte Inkubationszeit führte zu einer Verbesserung der antiaggregatorischen Aktivität. Das beste Ergebnis zeigte die Verbindung 16g ( IC50 = 2.5 µmol/L). Moderate IC50-Werte (IC50 ~ 13 µmol/L) wurden bei den Substanzen 6c, 16c and 16i im Born-Test beobachtet. Danach wurde der Einfluß der Testverbindungen auf die Bildung der Thrombi im Laser-Thrombose-Modell auf ihre antithrombotische Aktivität untersucht. Die Verbindung 6c zeigte die beste Hemmung der Thrombusbildung mit 10 % in den Arteriolen (5 % in den Venolen) nach einer oralen Einzeldosis von 60 mg/kg. Die Inhibition der Thrombusbildung in den Arteriolen wurde auch bei den Substanzen 16b, 16g, 16i, 16k, 16n und 19a beobachtet. Sie zeigten moderate (< 10 %) Effekte. Die Verbindungen 6c, 16c, 16g, 16i und 19a wurden für weitere Tests ausgesucht, weil sie die besten Resultate im Laser-Thrombose-Modell (in vivo) und/oder im Born-Test (in vitro) zeigten. Sie wurden mit spezifischeren Aggregationsauslösern wie z.B. Plättchen aktivierender Faktor (PAF) und Adrenalin sowie Adenosin-5�-diphosphat (ADP) anstelle des Kollagens untersucht. Verschiedene Mechanismen der antiaggregatorischen Eigenschaften wurden gefunden: Substanz 6c besitzt mit einem IC50-Wert von 0.7 µmol/L PAF- Rezeptor-antagonistische Eigenschaften. Die Substanz 16g hat mit einem IC50 -Wert von 2.5 µmol/L Kollagen-antagonistische Eigenschaften und zeigt mit einem IC50 -Wert von 4 µmol/L auch PAF-Rezeptor-antagonistische Eigenschaften. Zusätzlich wurde die vermutete Wirkung über die Aktivität der sGC und der PDE 5 mit zwei verschiedenen Radioimmunoassays überprüft. Die Resultate dieser Assays zeigten, daß die antiaggregatorische Wirkung von den Substanzen 6c, 16c, 16i und 19a nicht über eine Zunahme der sGC- oder eine Abnahme der PDE 5-Aktivität vermittelt wird. Zum Schluß wurden die Verbindungen 6c und 16g in einem Cyclooxygenase (COX)-1-Assay mit einer HPLC-Methode untersucht. Diese Verbindungen zeigten potente COX-1-inhibitorische Aktivitäten. Die IC50-Werte variierten von 0.42 µmol/L (Verbindung 6c) bis zu 0.94 µmol/L (Verbindung 16g).

The aim of this doctoral thesis was to develop new compounds with antiplatelet (in vitro) and antithrombotic (in vivo) properties, using the sGC-activator YC-1 and substance A, [4-[2-n-butyl-5-chloro-1-(2-chlorobenzyl)imidazolyl]methyl] acetate, as structural patterns. Substance A affects the cGMP metabolism by inhibition the cGMP phosphodiesterase (PDE 5). Ninety-nine 1-, 2-, 5-substituted 1H- imidazole-4-carboxylic acid derivates were prepared. The products were characterized by elemental analyses, 1H-NMR-, IR- and mass spectrometry technology. Then the compounds were assayed in a Born test (in vitro) for their antiplatelet effects. Collagen was used to induce platelet aggregation in platelet-rich plasma. Due to solubilty problems, the incubation time was prolonged from four minutes to twenty minutes. Increased incubation time led to raised antiplatelet activity. The best result presented compound 16g ( IC50 = 2.5 µmol/L). Moderate IC50-values (IC50 ~ 13 µmol/L) were observed when the substances 6c, 16c and 16i were examined in the Born test. After that the influence of the test compounds on the formation of thrombi was assayed in a laser thrombosis-model (in vivo) for their antithrombotic activity. Compound 6c showed the best inhibition of thrombus formation with 10 % in arterioles (5 % in venules) after a single oral dose of 60 mg/kg. Inhibition of thrombus formation in arterioles was also observed in substances 16b, 16g, 16i, 16k, 16n and 19a. They exhibited moderate (< 10 %) effects. The compounds 6c, 16c, 16g, 16i and 19a were selected for further tests because they showed the best results in a laser-thrombosis model (in vivo) and/or in the Born test (in vitro). They were investigated for more specific inducers of blood clotting agents, e.g. platelet activating factor (PAF) and adrenaline and adenosine-5�-diphosphate (ADP), instead of collagen. Different mechanisms of antiplatelet properties were found: Substance 6c demonstrated an antiplatelet effect by antagonizing PAF (IC50 = 0.7 µmol/L). Substance 16g presented an antiplatelet effect by antagonizing collagen (IC50 = 2.5 µmol/L) and PAF (IC50 = 4 µmol/L). In addition the activation of sGC and the inhibition of PDE 5 were determined by using two different radioimmune-assays. The results of these assays demonstrated that the antiplatelet effects of the substances 6c, 16c, 16i and 19a are not mediated by increased sGC- or decreased PDE 5-activity. Finally, the compounds 6c and 16g were tested in a cyclooxygenase (COX)-1-assay by using a HPLC-method. These compounds exhibited potent COX-1-inhibitory activities. IC50-values varied from 0.42 µmol/L (compound 6c) to 0.94 µmol/L (compound 16g).