Eine präzise Tumordiagnostik und -klassifikation bilden die Grundlage der onkologischen Therapieentscheidung. In der pathologischen Diagnostik werden dazu standardmäßig morphologische und immunhistochemische Verfahren eingesetzt. Diese stoßen bei der Identifikation des Organursprungs einer Metastase allerdings häufig an ihre Grenze und der maligne Tumor kann nicht eindeutig klassifiziert werden. Bei der Diagnostik therapierelevanter Mutationen spielen darüber hinaus molekulargenetische Untersuchungen eine wichtige Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei komplementäre molekulare Ansätze zur Unterstützung der histomorphologischen Tumordiagnostik untersucht. Zuerst wurde getestet, ob eine gezielte Tiefensequenzierung von Zellblöcken (Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Zytologieproben) maligner Ergüsse möglich und diagnostisch relevant ist. In 15 von 20 Probenpaaren aus jeweils einer Tumorgewebeprobe und dem korrespondierenden Zellblock eines malignen Ergusses wurden übereinstimmende Genmutationen identifiziert. In vier dieser 15 Fälle konnten zusätzliche Mutationen entweder in der Gewebeprobe oder der Zytologie nachgewiesen werden, was auf eine räumlich-zeitliche Tumorentwicklung hinweist. In den übrigen fünf der 20 Probenpaare waren hingegen keine gemeinsamen Mutationen nachweisbar. Anschließend wurden über die Analyse von DNA-Methylierungs- oder Proteinprofilen zwei unterschiedliche molekulare Methoden zur Identifikation des Organursprungs bei unklaren Metastasen untersucht. Die hohe Organspezifität der DNA-Methylierungs- und Proteinprofile ermöglichte die Klassifikation der Tumorproben mithilfe maschinellen Lernens. Zunächst wurde ein DNA-Methylierungsprofil-basierter Tumorklassifikator etabliert, um pulmonale Metastasen eines Plattenepithelkarzinoms des Kopf-Halses (HNSC) von primären Plattenepithelkarzinomen der Lunge (LUSC) zu unterscheiden. Beide ähneln sich histomorphologisch und treten häufig bei Patienten mit HNSC auf. Zur Unterscheidung der DNA-Methylierungsprofile beider Tumortypen wurden drei maschinelle Lernverfahren eingesetzt. In einer unabhängigen Kohorte aus 279 Fällen (HNSC, LUSC, Lungennormalgewebe) erzielten die neuronalen Netzwerke (NN) eine Vorhersagegenauigkeit von 96,4 %, während Support Vector Machines (SVM) 95,7 % und Random Forests 87,8 % der Fälle korrekt klassifizierten. Außerdem wurden 50 von 51 Fällen (98 %) einer klinischen Kohorte mit den NN richtig als HNSC-Metastasen oder primäre LUSC eingeteilt. Danach wurde ein Proteinprofil-basierter SVM-Klassifikator zur Unterscheidung von fünf Tumortypen (HNSC, LUSC, pulmonale, kolorektale und pankreatische Adenokarzinome) entwickelt. Hierfür wurde eine Western-Blot-basierte Methode zur Multiplex-Proteomik („DigiWest“) eingesetzt und zunächst deren Anwendbarkeit auf Routinediagnostik-FFPE-Gewebe evaluiert. 102 der getesteten 634 Antikörper zeigten sich dafür geeignet und wurden zur Tumorklassifikation verwendet. In 25 gepaarten Primärtumoren aus Frisch- und FFPE-Gewebe erzielte der SVM-Klassifikator eine Vorhersagegenauigkeit von 90,4 % in Frischgewebe und 77,6 % in den FFPE-Proben. Zudem wurden in einer unabhängigen Kohorte aus 25 FFPE-Tumorproben 88 % der Fälle richtig klassifiziert. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass neben klassischen genomischen auch neuartige epigenetische und proteomische Verfahren einen wichtigen Beitrag zur Tumordiagnostik leisten können.
Precise cancer diagnostics and classification constitute the basis for oncological treatment selection. Histomorphology and immunohistochemistry are routinely used in pathological diagnostics but often reach their limits in identifying the tissue of origin of metastases, and cancer cannot be classified. Moreover, molecular genetic testing is crucial in the detection of therapeutically relevant mutations. In this thesis, we explored three complementary molecular approaches to support histomorphological cancer diagnostics. First, we tested the feasibility and diagnostic relevance of targeted deep sequencing of malignant effusion cell blocks (formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cytology samples). 15 of 20 matched samples, each containing a tumor tissue sample and a malignant effusion cell block, showed concordant gene mutations. In four of these 15 cases, additional mutations were detected in either the tissue sample or cell block, indicating spatiotemporal tumor evolution. However, no concordant mutations were detected in the remaining five matched samples. Next, two different methods based on the analysis of either DNA methylation or protein profiles were used to identify the tissue of origin of undetermined metastases. The high organ specificity of both methods enabled the classification of tumor samples by machine learning. Firstly, a DNA methylation-based classifier was established to differentiate pulmonary metastases of head and neck squamous cell carcinomas (HNSC) from primary lung squamous cell carcinomas (LUSC). Both share similar histomorphology and frequently occur in patients with HNSC. Three machine learning methods were applied to distinguish both tumor types. Neural networks (NN) accurately classified 96.4% of 279 independent cases (HNSC, LUSC, normal lung tissue), while support vector machines (SVM) and random forests reached an accuracy of 95.7% and 87.8%, respectively. Furthermore, NN correctly distinguished primary LUSC from HNSC metastases in 98% of 51 clinical cases. Secondly, a protein profile-based SVM classifier was developed to distinguish five tumor types (HNSC, LUSC, pulmonary, colorectal, and pancreatic adenocarcinomas). To this end, we used a western blot-based method for multiplex proteomics (“DigiWest”), which we first evaluated for its applicability to routine diagnostics FFPE tissue. 102 of 634 tested antibodies were suitable for this purpose and were applied for cancer classification. The SVM classifier yielded an accuracy of 90.4% in fresh frozen and 77.6% in FFPE tissue in a set of 25 paired fresh frozen and FFPE primary tumor samples. Moreover, 88% of 25 independent FFPE tumor samples were classified correctly. In summary, these results demonstrate that besides classic genomic analysis, novel epigenetic and proteomic methods may valuably contribute to cancer diagnostics.
