Struktur und Funktion des tight junction-Proteins Occludin unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen

Abstract

5\. Zusammenfassung TJs sind Multiproteinkomplexe, die die parazelluläre Permeation hydrophiler Substanzen über Endo- und Epithelien regulieren. Sie determinieren die Zellpolarität und sind an zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt. Die Rolle des TJ-Markerproteins Occludin ist unklar. Die Arbeit analysiert insbesondere die Interaktionseigenschaften von Occludin nach systematischem Alaninscan hochkonservierter Cysteine. Weiterhin wurde die Regulation dieser Eigenschaften sowohl durch Hypoxie und Reduktantien als auch durch Phosphorylierung untersucht. Ein zusätzlicher Aspekt ist die Analyse der Auswirkungen der Cysteinsubstitutionen auf funktionelle Parameter (Dichtheit, Diffusibilität) und die Strangmorphologie. Die Untersuchungen ergaben, dass die EZS2 von Occludin eine cysteinabhängige und somit redoxsensitive Oligomerisierungsdomäne darstellt. Die Ausbildung einer abgeschirmten, intramolekularen Disulfidbrücke zwischen beiden EZS2-lokalisierten Cysteinen (Cystein216 und -237) bedingt eine aus zwei ß-Strängen und einer α-Helix bestehende Struktur. Diese bestimmt die trans- und cis-Interaktionen sowie die Membranlokalisation und -mobilität von Occludin und geht unter reduzierenden Bedingungen (Hypoxie, DTT) verloren. Die Disulfidbrücke kann als Ursache der Redoxsensitivität von Occludin angesehen werden. Die Gesamtheit der Resultate bezüglich der EZS2 führte zur Konstruktion eines ersten molekularen Modells. Das Cystein82 (TMD1) wurde als Bestandteil einer weiteren Interaktionsfläche von Occludin, innerhalb der Zellmembran, identifiziert. Diese Interaktion ist jedoch nicht redoxsensitiv, sondern beruht möglicherweise auf intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen mit benachbarten Resten. Der Austausch von Cystein82 wirkt sich nur auf die homologen cis-Interaktionen, nicht aber auf die homologen trans-Interaktionen aus. Die Cysteine76 (TMD1) und -148 (TMD2) verstärken die trans-Interaktion von Occludin, sind aber nicht redoxsensitiv. Die starke Zunahme der trans- Interaktion nach Austausch gegen Alanin scheint Ergebnis einer durch die Mutationen wegfallenden räumlichen Behinderung zu sein. Es konnte belegt werden, dass sich reduzierende Bedingungen direkt auf bereits membranständiges Occludin auswirken. Durch den Verlust der Disulfidbrücke verändert sich die EZS2-Struktur, was zur Internalisierung von Occludin führt. Dieses Resultat unterstreicht das Konzept von Occludin als Redoxsensor. Untersuchungen mittels FRET ergeben eine Interaktion zwischen Occludin und Claudin-1. Weiterhin ist ein deutlich verstärkender Einfluss der OccludinC76A Mutante, auf die Strangdichte und -länge von Claudin-1 in HEK-Zellen und den transzellulären Widerstand von MDCK-II-Zellen nachweisbar. FRET-Messungen zwischen ZO-1 und Occludinmutanten, die CK2-Phosphorylierung imitieren bzw. inhibieren, zeigten reduzierte Heterooligomerisierung durch Imitation der CK2-Phosphorylierung. Auch die Homooligomerisierung von Occludin ist CK2-beeinflusst. Das heißt, CK2-bedingte Phosphorylierung beeinträchtigt die TJ-Ausbildung. Die Mutante Y220A (Bestandteil der EZS2-Tertiärstruktur) vermindert die homophile trans- Interaktion sowie deren Redoxsensitivität unter Hypoxie. Die Cysteine76, -82 und -216 von Occludin beeinflussen dessen Interaktion mit MarvelD3. Für Cystein82 konnte ein Einfluss auf die heterologe Interaktion von Occludin mit Claudin-1 ausgeschlossen werden. Insgesamt trägt die Analyse cysteinbasierter Interaktionen durch Identifikation heterologer und homologer Interaktionsbereiche dazu bei die molekulare und regulatorische Organisation von TJs besser zu verstehen.

6 Summary TJs are multiprotein complexes regulating the epi-/endothelial permeation of hydrophilic substances. They determine cell polarity and play a central role in lots of physiologic and pathologic processes. The role of occludin, a marker protein of TJs, is unclear. Particularly, interaction properties of occludin were studied by systematic alanine scan of highly conserved cysteine residues. Furthermore, regulation of these properties by hypoxia/ and/or reductants as well as phosphorylation were analyzed. An additional aspect is the investigation of the impact of the cysteine substitution on functional parameters (i.e. tightness) and strand morphology. The results show, that the ECL2 of occludin is a cysteine-dependent and thus redox-sensitive oligomerization domain. Formation of a shielded intramolecular disulfide bridge between the ECL2 localized cysteines216 and -237 causes a tertiary structure, consisting of two ß-strands and an α-helix. This structure determines the cis- and trans-interactions as well as membrane localization and mobility at cell cell-contacts and gets lost under reducing conditions (i.e., hypoxia, DTT). This disulfide bridge is thought to base the redox sensitivity of occludin. The ECL2-related results led to the construction of the first molecular model of this loop. Cysteine82 (TMD1) is part of another interaction face of occludin within the cell membrane. The interaction based on this residue is not redox sensitive but probably based on intermolecular hydrogen bonds with neighboured residues. The only impact of cysteine82-substitution was the reduction of homologous cis-interactions. Trans-interactions were unaffected. Cysteines76 (TMD1) and -148 (TMD2) enhance homologous trans-interactions, but are not redox sensitive. The strong increment of the trans-interactions after substitution of cysteine by alanine seems to be the result of a mutation-based abolition of a spatial hinderence. It could be prooven, that reducing conditions influence membrane incorporated occludin. The ECL-2 structure changes by the loss of the disulfide bridge, which leads to the internalization of occludin. This result emphasizes the concept of occludin as redox sensor. FRET-investigations show an interaction between occludin and claudin-1. The occludin C76A mutant increases the claudin-1-based strand-density and -length in HEK-cells and the TEER in MDCK- II-cells. Associations between ZO-1 and occludin mutants, imitating or inhibiting CK2-phosphorylation measured by FRET, show reduced heterooligomerization and homooligomerization of occludin due to imitation of CK2-phosphorylation. This means, phosphorylation by CK2 modulates TJs. The mutant Y220A (part of the ECL2 tertiary structure) reduces homophilic trans- interactions and their redox sensitivity under hypoxia. Occludins cysteines76, -82 and -216 influence the interaction with marvelD3. For cysteine82, an influence on the interaction between occludin and claudin-1 could be excluded. In conclusion, the analysis of cysteine-based interactions leads to a better understanding of the molecular and regulatory organization of TJs by identification of heterologous and homologous interaction sites.