Olfactory processing in honeybee Kenyon cells and the involvement of the GABAergic system

Abstract

In this thesis I investigated the representation and processing of odor information in mushroom body intrinsic cells of the honeybee Apis mellifera. For this purpose I applied a calcium imaging technique after retrogradly staining the cells. Subject of this work were in particular the clawed Kenyon cells (KC) receiving olfactory input in the lip neuropil of the mushroom body calyces. They are the second order interneurons in the olfactory pathway and exist in extremely high number compared to the MB afferent neurons - the projection neurons, and the efferent output neurons. This suggests a reorganization of the coding principles which is the subject of study in my thesis. Coding in KCs is without much doubt done in a combinatorial way; individual cells were shown to respond in a sparse manner upon olfactory stimuli, i.e. each cell responds only to selected odors and its responses consist of only a few spikes. I analyzed whether KCs are also selective for particular odor concentrations. Investigating the concentration dependency of odor responses in the MB I could (1) show that individual Kenyon cells are not selective for narrow ranges of concentration and (2) the response magnitude over the monitored region is positively correlated to the odor concentration; (3) odor evoked responses at odor offset also show concentration dependency. Application of GABA receptor antagonists revealed (4) that odor responses to high odor concentrations are mediated by GABAergic inhibition via ionotrophic and metabotrophic GABA receptors. This can be understood as a gain control mechanism. I also addressed the temporal characteristics of KC firing and found that responses are invariant for different stimulus lengths. Further, I found that temporal sparseness is not caused by GABA transmission, as it was proposed previously, but by a neuron intrinsic mechanism that leads to a fast decay of any odor evoked calcium response. In addition I show physiological differences between median and lateral calyces in respect to the response strength and their impairment by GABA. Taken together, I conclude that odor processing is complex and involves several GABAergic networks which interact in the odor representation in the mushroom body. Deciphering the principles of odor processing in the mushroom body still needs further efforts using advanced technologies and new scientific strategies. I introduce first steps towards a new approach for staining cells more selectively via in vivo electroporation.

In der vorliegenden Arbeit wurden Duft - Repräsentation und - Prozessierung in den intrinsischen Neuronen des Pilzkörpers der Honigbiene, Apis mellifera, untersucht. Dazu wurden die zu untersuchenden Zellen zunächst retrograd gefärbt um dann eine opto-physiologische Methode, das Calcium Imaging, anzuwenden. Gegenstand dieser Arbeit waren die sogenannten clawed Kenyon Zellen, welche in der Lippe des Pilzkörpers olfaktorischen Eingang bekommen. Die Lippe ist ein Teil des Calyx‘, welcher der sensorische Eingangsbereich des Pilzkörpers ist. Die Kenyon Zellen sind Interneurone zweiter Ordnung im olfaktorischen Verarbeitungsweg. Sie kommen, verglichen mit den ihnen vorgeschalteten Projektionsneuronen und den ihnen nachgeschalteten Ausgangsneuronen, in sehr großer Zahl vor. Dies lässt auf eine Umorganisation des Kodierungsprinzips von einer Zellebene auf die nächste schließen. Dieses Prinzip ist das Untersuchungsobjekt dieser Arbeit. Bereits bekannt ist, dass die Kodierung in Kenyon Zellen in kombinatorischer Weise geschieht. Jede Zellen reagiert nur auf ausgewählte Düfte und die Antwort besteht aus nur wenigen Aktionspotentialen. Es wurde während dieser Arbeit untersucht, ob einzelne Kenyon Zellen auch selektiv auf bestimmte Duftkonzentrationen antworten. Untersuchungen zur Konzentration-abhängigkeit von Duftantworten im Pilzkörper ergaben, (1) dass individuelle Zellen nicht spezifisch für enge Konzentrationsspannen sind, (2) Die gemittelte Antwortstärke positiv mit der Duftkonzentration korreliert, und (3) die Stärke von duftvermittelte Antworten am Ende des Stimulus, sogenannten OFF-Antworten, konzentrationsabhängig ist. Mittels der Applikation von GABA-Rezeptor-Antagonisten konnte (4) gezeigt werden, dass die Duftantworten auf hochkonzentriere Düfte durch eine GABAerge Inhibition an ionotrophen und metabotrophen Rezeptoren beeinflusst wird. Dies wird als ein Regulierungsmechanismus angesehen. Desweiteren wurden zeitliche Eigenschaften der Aktivität von Kenyon Zellen betrachtet. Dies ergab, dass die zeitliche Ausdehnung der Aktivität nicht von der Länge des Stimulus‘ abhängt. Ferner ist die zeitlich sparsame Antwort nicht von der Ausschüttung des Transmitters GABA abhängig, wie bisher angenommen, sondern es handelt sich dabei um einen zell-intrinsischen Mechanismus, der dazu führt, das die duftvermittelte Aktivität schnell zurückgeht. Weiterhin wurden physiologische Unterschiede zwischen den beiden Calyces eines Pilzkörpers aufgezeigt, und zwar in Bezug auf die Antwortstärke und ihre Beeinflussung durch GABA. Es kann geschlussfolgert werden, dass die Duft – Prozessierung ein hoch komplexer Vorgang ist und diverse GABAerge Netzwerke die Duftrepräsentation in den Pilzkörpern mitgestalten. Die Entschlüsselung der Prinzipien der Duftkodierung erfordert weitere Bemühungen unter Einbeziehung neuer Techniken und Forschungsansätze. Erste Schritte zu einem neuen Ansatz für die selektivere Färbung von Zellen mittels in vivo Elektroporation wurden vorgestellt.