Identification of stability- and instability-associated proteoglycan/ glycosaminoglycan patterns in human atherosclerotic lesions

Abstract

Background: PG core proteins and their GAG side chains are major constituents of the extracellular matrix of atherosclerotic plaques and play important pathophysiological roles. Non-invasive methods to identify stable and vulnerable atherosclerotic plaques are desirable for improving cardiovascular diagnostics. Recent studies have identified GAGs as potential targets for non-invasive imaging of atherosclerosis. Hypothesis and objective: It is assumed that human atherosclerotic plaques are characterized by specific PG/GAG patterns. The aim of this pilot study was to establish a platform for the acquisition of histological, glycoanalytical and gene expression data from within μm-thick segments of human atherosclerotic specimens, in order to identify stability- and instability-associated PG/GAG patterns. Methods: 30 carotid endarterectomy samples were collected, formalin fixated, decalcified and embedded in paraffin. Serial 6-μm sections were prepared for histology and immunohistochemistry. Movat pentachrome, alcian blue and picro-sirius red stainings were used to determine plaque morphology, GAG and collagen content. Immunostaining using antibodies against CD68, α-SMA and CD34 aimed to delineate macrophages, vascular smooth muscle cells and neovascularization. The samples were classified and the spatial distribution of GAGs was correlated to stability- and instability-associated morphological features. RNA was isolated from 30 μm sections and analyzed using microarray technology. GAGs were extracted from adjacent 200 μm sections, and after an enzymatic digestion of the polysaccharide chains to disaccharide units, high-performance liquid chromatography was performed. Results: GAGs were abundant in smooth muscle cell-, collagen- and calcification-rich areas, whereas inflamed regions were GAG-poor. The mRNA expression analysis revealed PG/GAG-related candidate genes whose expression patterns may associate with plaque vulnerability and inflammation. Based on these results, power analyses revealed the need to increase the sample size to 60-70 in order to achieve statistical significance. Preliminary glycoanalytical results suggested that CS/DS-4S and -6S are abundant in atherosclerotic lesions, and that alterations in their ratio may correlate with plaque morphology and instability. Conclusions: This thesis presents a research platform for the identification of PG/GAG patterns in human atherosclerotic plaques. Histological, glycoanalytical and gene expression data from a small number of samples provided first indications that stable and vulnerable atherosclerotic plaques exhibit characteristic PG/GAG patterns, out of which novel imaging targets may arise. Increasing the sample size to 60-70 would be required to statistically empower these results.

Proteoglykane (PG) und ihre Glukosaminoglykan (GAG)-Seitenketten sind Hauptbestandteile der Extrazellulärmatrix atherosklerotischen Läsionen und spielen eine wichtige Rolle bei der Krankheitsprogression. Methoden zur Erkennung von stabilen und instabilen atherosklerotischen Plaques sind für die Verbesserung der kardiovaskulären Diagnostik wünschenswert. Aktuelle Forschungsergebnisse identifizierten GAGs als potenzielle Ziele für die nicht-invasiven Bildgebung der Atherosklerose. Hypothese und Ziel: Es wird vermutet, dass humane atherosklerotische Plaques durch spezifische PG/GAG-Muster charakterisiert sind. Das Ziel dieser Pilotstudie war die Erstellung einer methodischen Plattform zur Erfassung histologischer, glykoanalytischer und genexpressionanalytischer Daten aus kleinen Segmenten menschlicher atherosklerotischer Plaques, um stabilitäts- und instabilitätsassoziierten PG/GAG-Muster zu identifizieren. Methoden: 30 Karotisendarteriektomie-Proben wurden asserviert. Nach Formalin-Fixierung und Dekalzifizierung folgte die Einbettung in Paraffin. Serielle 6 μm-Schnitte wurden für die Histologie und Immunhistochemie angefertigt. Movat-Pentachrom-, Alzianblau- und Picro-Sirius Rot-Färbungen dienten zur Bestimmung der Plaquemorphologie, des GAG- und des Kollagengehalts. Immunfärbungen mit Antikörpern gegen CD68, α-SMA und CD34 wurden zur Detektion von Makrophagen, zur Detektion der Verteilung von glatten Muskelzellen und zur Darstellung von Neovaskularization durchgeführt. Anhand der Histologie wurden die Proben klassifiziert und die räumliche Verteilung der GAG mit stabilitäts- und instabilitätsassoziierten morphologischen Merkmalen korreliert. Von 16 Proben wurde RNA aus 30 μm-Schnitten isoliert und mittels Microarray-Technologie analysiert. GAGs wurden aus benachbarten 200-μm-Schnitten extrahiert und nach einem enzymatischen Aufschluss der Polysaccharidketten zu Disaccharideinheiten mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert. Ergebnisse: Histologisch zeigte sich eine Anreicherung von GAGs in Bereichen mit vielen glatten Muskelzell-, sowie in kalzifizierten und kollagenreichen Arealen, während sich durch Inflammation gekennzeichnete Regionen GAG-arm erwiesen. Die mRNA Expressionsanalyse ergab PG-/GAG-assoziierte Kandidatengene, deren Expressionsmuster mit erhöhter Plaquevulnerabilität und Inflammation assoziiert sein könnte. Die auf Basis der Expressionsdaten durchgeführten Power Analysen ergaben, dass eine Stichprobenanzahl von 60-70 notwendig wäre, um statistisch gesicherte Ergebnisse zu erhalten. Präliminäre Glykoanalytikergebnisse zeigten, dass CS/DS-4S und -6S in atherosklerotischen Läsionen in großer Menge vorhanden sind und dass Alterationen in ihrer Relation mit der Morphologie und Instabilität der Plaques korrelieren könnten. Schlussfolgerung: In dieser Arbeit wird eine geeignete Forschungsplattform für die künftige Identifizierung stabilitäts- und vulnerabilitätsassoziierter PG-/GAG-Muster in humanen atherosklerotischen Plaques vorgestellt. Die Analyse histologischer, glykoanalytischer und genexpressionsanalytischer Daten aus einer kleinen Stichprobenzahl lieferte erste Hinweise darauf, dass stabile- und vulnerable atherosklerotische Plaques charakteristische PG/GAG Muster aufweisen, aus denen neue Bildgebungstargets generiert werden könnten. Die Erhöhung des Stichprobenumfangs auf 60-70 wäre notwendig, um statistisch gesicherte Ergebnisse zu erhalten.