Isolation und Charakterisierung von primären humanen Leberzellen und deren Anwendung in in vivo nahen in vitro Lebermodellen

Abstract

Diese Publikationspromotion umfasst drei in internationalen Fachzeitschriften publizierte Artikel, die sich mit der Isolation und Charakterisierung von primären humanen parenchymalen und nicht-parenchymalen Leberzellen (NPC) sowie deren Anwendung in in vitro Lebermodellen beschäftigen. Die klassische 2-dimensionale (2D) Kultur primärer humaner Hepatozyten (PHH) bildet den Goldstandard für die Untersuchung der in vitro Hepatotoxizität. Allerdings fehlt in diesen Kulturen die Anwesenheit NPC. Die NPC, zu denen Kupffer Zellen (KC), Leberendothelzellen (LEC) und hepatischen Stellat-Zellen (HSC) zählen, spielen eine zentrale Rolle bei physiologischen und pathophysiologischen Prozessen. Im Rahmen der Medikamenten-induzierten Leberschädigung (engl. Drug induced liver injury - DILI) kann es durch immunmodulierende Reaktionen von NPC sowohl zu einer vermehrten Schädigung des Lebergewebes, aber auch zur Induktion von immunologischer Toleranz kommen. Durch die Entwicklung innovativer Kokulturmodelle könnte die möglicherweise die immunologische Modulation von Hepatotoxiziät erfasst werden. Im Rahme dieser Publikationspromotion wurde eine Methode etabliert, um PHH und NPC aus demselben Lebergewebe zu isolieren. Nach erfolgreicher Identifizierung und Charakterisierung bildeten diese die Grundlage für die Etablierung eines in vitro Lebermodels zur Untersuchung immunologischer Reaktionen im Rahmen von DILI. PHH und NPC wurden mit Hilfe einer zweistufigen EDTA/Kollagenase- Perfusionstechnik aus einem Stück humanem Lebergewebe isoliert. Die in der NPC-Fraktion enthaltenen KC, LEC und HSC wurden mittels Adhärenz-Trennung und magnetischer Zellsortierung voneinander getrennt. Nach Identifikation der NPC mittels spezifischer Antikörper und immunfluoreszenz Mikroskopie konnten Ausbeuten von 1,9x106 KC, 2,7x105 LEC und 4,7x105 HSC pro g Lebergewebe mit Viabilitäten > 90% und Reinheiten > 90% verzeichnet werden. Die anschließende Charakterisierung funktioneller Parameter in Kultur über 5 Tage zeigte, dass KC über eine limitierte Lebenszeit verfügen, LEC sich aus einer heterogenen Mischpopulation zusammensetzen und HSC zur Transdifferenzierung in Myofibroblasten neigen. Um DILI zu simulieren wurden KC mit den Überständen von substanzbehandelten PHH stimuliert. Die KC Aktivierung wurde durch Messung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS, DCF-Assay) und der Zellaktivität (XTT- Test) sowie deren immunologische Reaktion mit Hilfe von verschiedenen Zytokin- ELISA evaluiert. In den KC konnte sowohl ein Anstieg der Zellaktivität, als auch eine donor-spezifische ROS-Bildung beobachtet werden. Zusätzlich zeigte sich eine donor- und medikamentenabhängige Ausschüttung von pro- und anti- inflammatorischen Zytokinen. Das beschriebene Isolationsprotokoll ermöglicht eine simultane Isolation von PHH und NPC in guter Qualität und Quantität aus einem Stück Lebergewebe. Die Charakterisierung zeigte, dass sich KC am besten für den Einsatz in einem Lebermodell eignen. Die Detektion sowohl donor- als auch medikamentenspezifischer immunologischer Reaktionen macht das etablierte Modell zu einem vielversprechenden Ansatz für die Untersuchung der Medikamenten induzierten Hepatotoxizität.

This thesis comprises three peer reviewed publications dealing with the isolation, and characterization of primary human parenchymal and non- parenchymal liver cells (NPC) and their application in in vitro liver models. 2 dimensional monocultures of primary human hepatocytes (PHH) are considered to be the gold standard for in vitro testing of hepatotoxicity. However, these models miss the presence of NPC. NPC consist of Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC), and hepatic stellate-cells (HSC) and play a central role in physiological and pathophysiological processes. Regarding drug-induced liver injury (DILI), NPC can modulate immunologic reactions leading to an augmented damage of the liver tissue but also to induction of immunologic tolerance. The development of innovative co-culture models could possibly help to understand the immunologic modulation of hepatotoxicity. This thesis outlines the establishment of a method to isolate PHH and NPC from the same liver tissue specimen. The successful identification and characterization paved the way for the establishment of an in vitro liver model for the investigation of immunologic reactions caused by DILI. PHH and NPC were isolated from human tissue samples using a two-step EDTA/collagenase perfusion technique. KC, LEC, and HSC were separated using specific adherence properties and magnetic activated cell sorting. The NPC were identified using specific antibodies and immunofluorescent microscopy. The quantifications revealed a yield of 1.9x106 KC, 2.7x105 LEC and 4.7x105 HSC per gram liver tissue, showing viabilities >90% and purities >90%. Subsequently, the characterization of functional parameters during a culture time of 5 days showed that KC dispose a limited life span, LEC consist of a heterogeneous population and HSC tend to transdifferentiate in myofibroblasts. For the simulation of DILI, KC were stimulated with supernatants from drug treated PHH. KC activation was investigated by the measurement of reactive oxygen species (ROS, DCF-assay) and cell activity (XTT-assay) and the immunologic reactions by analysis of cytokine production (ELISA). In KC an increase of cell activity as well as a donor specific ROS-formation was observable. Additionally, donor and drug dependent releases of pro- and anti-inflammatory cytokines were detected. The isolation protocol described, enables the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one piece of liver tissue. The characterization showed that KC were the most suitable cell type for usage in in vitro models. The detection of donor- as well as drug specific immunologic reactions makes the established model to a promising tool for the investigation of DILI.