Identifizierung potentiell immunogener Peptide auf Zellen der chronischen myeloischen Leukämie

Abstract

Die Vakzinierung von CML-Patienten mit tumorspezifischen oder tumorassoziierten Antigenen stellt einen möglichen Ansatz für eine CML- Immuntherapie dar. Die interessantesten Kandidaten für diesen Ansatz würden Peptide wie GFKQSSKAL, ATGFKQSSK, KQSSKALQR und SSKALQRPV aus der tumorspezifischen Fusionsregion des BCR-ABL-Proteins darstellen, sofern sie in CML-Zellen endogen prozessiert und auf MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert werden. In dieser Arbeit sollte die Prozessierung und endogene Präsentation dieser Peptide für CML-Zellen über den Ansatz der Reversen Immunologie untersucht werden. Darüber hinaus sollten neue, potentiell immuntherapeutisch relevante Peptide identifiziert werden.

Zunächst konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine Prozessierung der Peptide GFKQSSKAL, ATGFKQSSK und KQSSKALQR durch das konstitutive Proteasom möglich ist, die Schnittspezifität des Immunoproteasoms hingegen nur die Prozessierung des Liganden KQSSKALQR erlaubt. Die erhaltenen Resultate legten jedoch den Schluss nahe, dass der Ligand SSKALQRPV mit potentieller HLA-A2 Restriktion in vitro von keiner der beiden Proteasom- Spezies prozessiert werden kann. Wie anschließende Untersuchungen der Proteasom-Expression in CML-Zellen ergaben, wird in Zellen einiger CML- Patienten, vermutlich korrelierend mit dem Fortschritt der Erkrankung, ausschließlich das Immunoproteasom exprimiert.

Eine endogene Präsentation der BCR-ABL-Fusionsregionspeptide durch Analyse des MHC-Klasse-I-Peptidpools konnte weder im Tumormodell mit HLA-A3- und HLA-B8-transfizierten K562-Zellen noch für Zellen von CML-Patienten belegt werden. Im Gegensatz dazu gelang über den Ansatz der Reversen Immunologie die Identifizierung zahlreicher anderer, potentiell immuntherapeutisch relevanter Peptide insbesondere aus protoonkogenen Transkriptionsfaktoren. Der auf HLA-A3-positiven Zellen identifizierte Ligand KIADRIFFLY aus dem LIM-Domäne- Transkriptionsfaktor LMO4 erschien dabei am bemerkenswertesten. Dieser Ligand konnte auf allen untersuchten CML-Patientenzellen und auch auf HLA-A3-transfizierten K562-Zellen endogen präsentiert nachgewiesen werden, wurde nicht im Peptidpool gesunder Zellen (Leukozyten aus der Milz) detektiert und erste immunologische Untersuchungen in der Arbeitsgruppe zeigten, dass im Blut von einigen CML-Patienten KIADRFLLY-spezifische T-Zellen nachzuweisen sind. LMO4-KIADRIFFLY ist damit ein denkbarer Kandidat für eine CML- Vakzinierungstherapie. Für einen eventuellen immuntherapeutischen Einsatz LMO4-abgeleiteter Peptide konnten darüber hinaus weitere potentielle Kandidaten mit HLA-A2-Restriktion nach Epitopvorhersage über einen Peptidstabilisierungsversuch identifiziert werden.

Zusammengefasst wurden durch die umfangreiche Identifizierung von MHC- Klasse-I-Liganden sowohl auf CML-Zellen wie auch auf gesunden Leukozyten grundlegende Erkenntnisse gewonnen, welche sowohl für die Entschlüsselung von biologischen Mechanismen der Leukämogenese als auch für die Entwicklung einer Peptidvakzinierung zur zukünftigen Therapie der chronischen myeloischen Leukämie wichtig sind.

Tumor vaccination with tumor specific or tumor-associated peptides is an attractive therapy strategy for chronic myeloid leukemia (CML). Peptides derived from the tumor specific fusion region of the BCR-ABL protein such as GFKQSSKAL, ATGFKQSSK, KQSSKALQR and SSKALQRPV are potentially ideal candidates for such a vaccination, provided they are endogenously processed and presented by CML cells. In a reverse immunology approach, processing and endogenous presentation of these peptides was investigated. Moreover we anticipated to isolate and define other therapeutically relevant peptides.

We could demonstrate that the BCR-ABL peptides GFKQSSKAL, ATGFKQSSK and KQSSKALQR can be indeed specifically cleaved by the constitutive proteasome, while cleavage specificity of the immunoproteasome was restricted to processing of KQSSKALQR. Our results however suggest that the putative HLA-A2 binding peptide SSKALQRPV cannot be generated - at least in vitro \- via cleavage by either the constitutive or the immunoproteasome. Analysis of proteasome expression in different patients showed that in some cases, mostly with advanced disease, only the immunoproteasome was expressed in the CML cells. Analysis of the MHC-bound peptide pool eluted from HLA-A3 or HLA-B8 transfected bcr-abl positive K562 cells as well as from native CML cells failed to detect BCR-ABL fusion peptides.

Conversely the reverse immunology approach allowed us to identify several other potentially immunogenic peptides, especially from proto-oncogenic transcription factors. The finding that the LIM-domain transcription factor LMO4 derived peptide KIADRFLLY could be eluted from all HLA-A3 positive patient samples as well as from HLA-A3 transduced K562 cells but not from normal human splenocytes, was particularly striking. First analyses of patients blood probes performed in our group suggest that T cells able to recognize KIADRFLLY are present in some CML patients indicating that LMO4-KIADRFLLY is indeed a potential candidate for CML vaccination. In order to broaden the spectrum of patients that could be potentially treated, we have evaluated LMO4 epitopes predicted to bind to HLA-A2 according to computer- based algorithms in a peptide-binding assay.

In summary, the extensive identification of MHC-class I binding peptides from leukemic cells and normal leukocytes have provided valuable information for both the development of peptide vaccines and the identification of molecules that may play a role in CML leukemogenesis.