Investigation of stimuli-responsive nanogels as promising candidates to overcome multifaceted barriers: focus on mucosal delivery with related opportunities, issues, and challenges

Abstract

Efficient pharmacotherapy is mainly dependent on the effective localized delivery of therapeutic agents to the targeted biological site. Many potent therapeutics exhibit detrimental effects owing their systemic administration and off-target interactions. Hence, local drug formulations have become a necessity to optimize current treatments. Such formulations, however, must address, the unsuited physicochemical properties of drug molecules on one hand, and the obstructive nature of the targeted biological barrier on the other. In this context, nanosized drug delivery systems have literally taken modern medicine to a new dimension by providing adaptable vehicles able to transfer and stabilize therapeutics. Responsive nanogels, in particular, offer biocompatible and versatile tools that can be tuned to suit the targeted barrier requirements in order to facilitate smart delivery and controlled release of the payload. Aiming to overcome the highly challenging dermal and mucus barriers and provide respectively efficient non-invasive formulations of labile biomacromolecules, the goal of this project was the rational investigation of polyglycerol based nanogels exerting two different response mechanisms as promising vehicles for dermal and mucosal applications. In the dermal delivery approach, thermoresponsive dPG nanogels were modified to exhibit different volume phase transition temperatures (VPTTs) ranging between 33 – 47 °C using PNIPAM and PNIPMAM thermoresponsive polymers. All nanogels demonstrated high protein encapsulation efficiency (>80%), maintained integrity of protein cargo, and exhibited dermal penetration and subsequent VPTT-dependent protein release and delivery to the viable epidermis in excised human skin. Here, the equal co-polymerization of PNIPAM and PNIPMAM yielded nanogels with VPTT ~40 °C, which enabled to expand dermal applications to include using an external thermal trigger like NIR lamp resulting in pronounced protein delivery in a controlled local and temporal manner. As for the mucosal delivery approach, for the first time redox-responsive dPG nanogels based on PNIPMAM conjugated to a bifunctional disulfide linker were developed and comprehensively investigated for protein delivery across the mucus barrier. Addressing essential prerequisites for mucus permeation, the nanogels physicochemical properties were fine-tuned to yield hydrophilic nanogels with size range between 100 – 200 nm, inert surface, and intact disulfide linkages. Monitoring the interactions between the nanogels and native intestinal mucus, a gradual disulfides-dependent degradation of the nanogels in mucus was confirmed. Furthermore, rheological measurements indicated mucoadhesive interactions between the mucus gel and the disulfides-containing nanogels, meanwhile absorption studies in excised porcine jejunum revealed outstanding mucopenetration of the disulfides-containing nanogels and demonstrated the disulfides merit in facilitating efficient circumvention of the mucus filtering and clearance mechanisms. Similar findings were also confirmed in reconstructed human bronchial epithelial in vitro models following longer exposure period to the nanogels. In addition, the cytocompatibility of the nanogels was also demonstrated in various mucosal epithelial cell types and primary macrophages as well. Next, the therapeutic efficiency of the nanogels in delivering the biological protein-drug etanercept (ETN; 150 kDa) was examined. Here, high loading efficiency along with structural and functional stability of encapsulated ETN were observed. Moreover, in vitro release studies in mucus-relevant redox conditions confirmed ETN retention in the nanogels for several hours and its sustained intact release upon nanogels degradation, which demonstrate the great potential of disulfides-containing nanogels for biomacromolecules delivery. Finally, topical application of ETN-loaded nanogels to human-based in vitro models of small intestinal tissue simulating IBD phenotype and bronchial epithelial tissue demonstrated efficient intraepithelial ETN delivery and subsequent anti-inflammatory effect. Throughout this investigation, serious issues pertaining to structural limitations in the available biological test systems for intestinal mucosa were revealed. Since these shortcomings significantly hamper drug absorption studies, multiple mucosal test systems were employed to validate the findings and allow a comprehensive and reliable assessment. Overall, this thesis introduces novel stimuli responsive nanogels as versatile and resilient tools for efficient local delivery of biomacromolecules to dermal and mucosal surfaces. It also demonstrates the role of the responsive modalities in facilitating the crossing of impervious biological barriers besides prompting a controlled release of the therapeutic payload. In addition, this work highlights critical problems in currently implemented test systems for predicting mucosal drug delivery and outlines present challenges in translating experimental approaches into tangible clinical success.

Eine effiziente Pharmakotherapie hängt hauptsächlich davon ab, dass die therapeutischen Wirkstoffe effektiv an den biologischen Zielort gelangen. Viele potente Therapeutika weisen aufgrund ihrer systemischen Verabreichung und Off-Target Wechselwirkungen nachteilige und sogar schädliche Auswirkungen auf. Daher sind lokale Arzneimittelformulierungen zu einer Notwendigkeit geworden, um die derzeitigen Behandlungen zu optimieren. Solche Formulierungen müssen jedoch berücksichtigen die ungeeigneten physikochemischen Eigenschaften der Wirkstoffmoleküle einerseits, sowie die obstruktiven Eigenschaften der biologischen Zielbarriere andererseits. In diesem Zusammenhang haben Wirkstofftransportsysteme in Nanometer-Größe die moderne Medizin tatsächlich zu einer neuen Dimension gebracht, indem sie sich als flexible Vehikel, die die Therapeutika übertragen und stabilisieren herausgestellt haben. Vor allem responsive Nanogele bieten biokompatible und vielfältige Werkzeuge, die gemäß spezifischen Anforderungen der Zielbarriere angepasst werden können, um eine so genannte „smarte“ Verabreichung und kontrollierte Freisetzung des beladenen Mittels zu ermöglichen. Mit dem Ziel, die besonders anspruchsvollen Haut- und Schleimhautbarrieren zu überwinden und jeweils effiziente, nicht-invasive pharmazeutische Formulierungen für labilen Biomakromolekülen bereitzustellen, beruht sich der Schwerpunkt dieses Projekts auf die rationale Untersuchung von responsive Nanogele basierend auf Polyglycerin, die zwei unterschiedliche Response-Mechanismen aufweisen, als vielversprechende Transport-systeme für dermale und mukosale Anwendungen. Für den dermalen Ansatz wurden thermoresponsive Nanogele so modifiziert, dass sie unterschiedliche Volumenphasenübergangstemperaturen (VPTT) zwischen 33 und 47 °C aufweisen, wobei die thermoresponsiven Polymere PNIPAM und PNIPMAM verwendet wurden. Alle Nanogele zeigten eine hohe Protein-Verkapselungseffizienz (>80 %), bewahrten die Integrität des verkapselten Proteins, und konnten eine dermale Penetration mit VPTT-bedingter Freisetzung des Proteins und anschließender Abgabe in die lebensfähige Epidermis in exzidierter menschlicher Haut nachweisen. Durch die gleichmäßige Co-Polymerisation von Poly-N-Isopropylacrylamid (PNIPAM) und Poly-N-isopropylmethacrylamid (PNIPMAM) führte zu Nanogelen mit einer VPTT von ca. ~40 °C, was eine Erweiterung der dermalen Anwendungen ermöglichte, indem eine Verwendung externer Wärmequellen, wie einer Nahinfrarot-Lampe löst eine ausgeprägte Abgabe von Proteinen in die Haut auf kontrollierte lokale und zeitliche Weise aus. Was den Schleimhaut Ansatz betrifft, wurden zum ersten Mal Redox-responsive Nanogele aus PNIPMAM Polymer mit bifunktionellen Disulfid-Vernetzer entwickelt und für die Verabreichung von Proteinen über die Schleimbarriere umfassend untersucht. Mit Blick auf die wesentlichen Voraussetzungen für effiziente Mukus-Permeation, wurden die physikochemischen Eigenschaften der Nanogelen feinjustiert, um hydrophile Nanogelen mit einer Größe zwischen 100 und 200 nm, einer inerten Oberfläche, sowie intakten Disulfid-Bindungen zu erhalten. Die Überwachung von Wechselwirkungen zwischen den Nanogelen und nativem Darmschleim bestätigte einen allmählichen Disulfid-abhängigen Abbau der Nanogele in Mukus. Außerdem deuteten rheologische Messungen auf mucoadhäsive Wechselwirkung zwischen Mukus und Disulfid-haltigen Nanogelen hin. Zugleich zeigten Absorptionsstudien in frisch exzidiertem Schweine-Jejunum eine hervorragende Mukopenetration der Disulfid-haltigen Nanogelen und belegten die Vorzüge von Disulfiden in Bezug auf eine effiziente Überwindung der Mukus-korrelierten Filter- und Clearance-Mechanismen. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in rekonstruierten menschlichen bronchialen Epithelmodellen in vitro nach längerer Expositionsdauer zu den Nanogelen bestätigt. Zudem wurde die Zytokompatibilität der Nanogelen auch in verschiedenen Schleimhautepithelzelltypen sowie primären Makrophagen nachgewiesen. Als Nächstes wurde die therapeutische Effizienz der Nanogelen bei der Verabreichung vom Biologikum-Protein Etanercept (ETN; 150 kDa) untersucht. Dabei wurden eine hohe Verkapslungs-effizienz sowie eine strukturelle und funktionelle Stabilität des verkapselten ETN festgestellt. Zudem ergaben in vitro Freisetzungsstudien unter Mukus-relevanten Redox-Bedingungen, dass ETN mehrere Stunden lang in den Nanogelen aufbewahrt geblieben ist und weiterhin schrittweise unversehrt freigesetzt wurde beim Abbau der Nanogelen, was das große Potenzial von Disulfid-haltigen Nanogelen für die Verabreichung von Biomakromolekülen belegte. Die topische Anwendung von ETN-beladenen Nanogelen auf humane in vitro Modelle des Dünndarmgewebes, die das Krankheitsbild der chronisch-entzündlichen Darmerkrankung (IBD) simulieren, und auf bronchiales Epithelgewebe zeigten schließlich eine effiziente intraepitheliale ETN Verabreichung und entsprechende entzündungshemmende Wirkung. Im Laufe dieser Untersuchung wurden ernste Probleme in Bezug auf strukturelle Einschränkungen in den verfügbaren biologischen Testsystemen für die Darmschleimhaut festgestellt. Da solche Mängel die Studien zur Arzneimittelabsorption erheblich beeinträchtigen, wurden mehrere Schleimhaut-Testsysteme hierzu eingesetzt, um die Ergebnisse zu validieren und eine umfassende und zuverlässige Bewertung zu ermöglichen. Insgesamt sind in dieser Arbeit neue responsive Nanogele als vielseitige und flexible Werkzeuge für die effiziente lokale Abgabe von Biomakromolekülen an die Haut- und Schleimhautoberflächen dargestellt. Weiterhin wird die Rolle der responsiven Modalitäten bei der Durchquerung von den robusten biologischen Barrieren neben der kontrollierten Freisetzung der therapeutischen Fracht demonstriert. Außerdem wurden kritische Probleme bei den bestehenden Testsystemen zur Voraussage von Medikamenten-Verabreichung über die Schleimhäute hervorgehoben und die aktuellen Herausforderungen erläutert, um den entsprechenden experimentellen Verfahren in greifbaren klinischen Erfolg umzusetzen.