Einflussfaktoren auf die angiogene Potenz humaner mikrovaskulärer Endothelzellen in vitro

Abstract

Bei der Entwicklung anti-/angiogener Therapien werden erste Versuche hinsichtlich der Wirksamkeit einer Substanz in in vitro-Modellen durchgeführt. Dafür ist es erforderlich, dass isolierte Endothelzellen bei der Kultivierung in einem Angiogenese-Modell durch den Einsatz eines proangiogenen Kultivierungsmediums aktiviert und zur Angiogenese stimuliert werden können. Bei der Kultivierung humaner mikrovaskulärer Endothelzellen unterschiedlicher Organe und Firmen in einem all-in-one-Modell [11] beobachteten Bahramsoltani und Plendl [12], dass diese Zellen trotz Kultivierung in proangiogenen Kultivierungsmedien deutliche Unterschiede hinsichtlich ihrer angiogenen Potenz aufweisen können. Daher war das Ziel der vorliegenden Arbeit, potentielle Einflussfaktoren auf die angiogene Potenz humaner mikrovaskulärer Endothelzellen in vitro systematisch zu untersuchen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen, dass kultivierte Endothelzellen prägnante Unterschiede hinsichtlich ihrer angiogenen Potenz aufweisen können. Diese wurden sowohl zwischen Endothelzellen unterschiedlicher Organe als auch unterschiedlicher Zellspender sowie zwischen Endothelzellen innerhalb derselben Kultur beobachtet. In der Ausprägung ihrer angiogenen Potenz können sie dabei maßgeblich durch die Kultivierungsbedingungen beeinflusst werden. Die Beobachtungen aus den letzten beiden Studien der vorliegenden Arbeit deuten zudem darauf hin, dass bestimmte Endothelzellen sogar dazu in der Lage sind, vermutlich als Reaktion auf die Kultivierungsbedingungen, ihren Phänotyp zu ändern und die Funktion nicht vorhandener Zellen, wie zum Beispiel Perizyten, vaskulären Myozyten oder Makrophagen zu übernehmen. Demnach kann angenommen werden, dass die angiogene Potenz einer Endothelzelle das Resultat einer Interaktion dieser Zelle mit ihrer Umwelt ist, so dass die Ergebnisse von in vitro-Studien zur Angiogenese in erster Linie von der verwendeten Endothelzellcharge sowie den Kultivierungsbedingungen abhängen. In Anbetracht des mannigfaltigen Angebots an unterschiedlichen Zellchargen sowie Kultivierungsbedingungen stellt sich daher die Frage, inwiefern in vitro- Studien zur Angiogenese sicher reproduzierbar sind. Wissenschaftliche Veröffentlichungen über nicht-angiogene Endothelzellen gibt es kaum. Dies gibt Grund zur Annahme, dass bei der Durchführung von in vitro-Studien zur Angiogenese der Einsatz unterschiedlicher Endothelzellchargen sowie Kultivierungsbedingungen als Einflussfaktoren auf die angiogene Potenz kultivierter Endothelzellen nicht ausreichend berücksichtigt und Studien zur Reproduzierbarkeit nicht durchgeführt wurden, infolgedessen es womöglich zu falsch-positiven/-negativen Ergebnissen gekommen sein könnte. Die vorliegende Arbeit verdeutlicht, dass Ergebnisse aus in vitro-Studien zur Angiogenese ausschließlich auf die in der jeweiligen Studie verwendeten Zellen und Kultivierungsbedingungen bezogen werden dürfen. Es ist dringend erforderlich, die gewonnenen Ergebnisse validierten Kontrollen zu unterziehen und in weiteren Modellen, auch unter Verwendung anderer Zellchargen, zu bestätigen. Die vorliegende Arbeit hebt ebenfalls deutlich die Relevanz der Veröffentlichung negativer Ergebnisse hervor, um auf derartige Beobachtungen in in vitro-Studien zur Angiogenese aufmerksam machen zu können. Die Tatsache, dass sich kultivierte Endothelzellen trotz Einsatz eines proangiogenen Kultivierungsmediums als nicht-angiogen erweisen können, muss bei der Durchführung von in vitro-Studien zur Angiogenese unbedingt berücksichtigt werden. Die Etablierung universeller Marker könnte eine Unterscheidung angiogener von nicht-angiogenen Endothelzellen ermöglichen.

In the development of anti-/angiogenic therapies, initial tests concerning the effectiveness of a substance are performed in in vitro assays. For this purpose, it is necessary to activate and stimulate isolated endothelial cells to angiogenesis by using a proangiogenic growth medium in an angiogenesis- assay for their cultivation. Bahramsoltani and Plendl [12], however, illustrated in an all-in-one-assay [11] that cultivated human microvascular endothelial cells of different organs and distributors can show noticeable differences concerning their angiogenic potency, despite cultivation in proangiogenic growth media. Therefore, the aim of the present thesis was the systematic investigation of potential influences on the angiogenic potency of human microvascular endothelial cells in vitro. The results of the present thesis confirm that cultivated endothelial cells display distinct differences in regard to their angiogenic potency. Differences were observed between endothelial cells of different organs as well as different cell donors, and between endothelial cells within the same cell culture. In manifestation of their angiogenic potency, endothelial cells are decisively influenced by the cultivation conditions. Observations from the two last studies of this thesis indicate that certain endothelial cells are able to alter their phenotype and to take on the role of cells which are not present, like pericytes, vascular myocytes or macrophages, presumably in answer to the cultivation conditions. Thus, it can be assumed that the angiogenic potency of cultivated endothelial cells is the result of the interaction of these cells with their environment, so that findings of in vitro-studies of angiogenesis can primarily depend on the used cell batch as well as the cultivation conditions. Considering the various range of different cell batches as well as the different cultivation conditions available, the question arises whether in vitro-studies in angiogenesis research are reproducible in a reliable manner. There are hardly any scientific publications concerning non-angiogenic endothelial cells. This gives reason to believe that in previous studies, the influence on the angiogenic potency of cultivated endothelial cells by using different endothelial cell batches as well as cultivation conditions were not taken adequately into account, and that reproducibility studies were not performed. Consequently, the results of in vitro-studies could be misinterpreted. The present thesis shows that the results of in vitro-studies concerning angiogenesis may only be interpreted within the scope of the cell batches and cultivation conditions used. It is necessary to further validate the results using different assays, such as validated control assays, and cell batches. Furthermore, the present thesis clearly indicates the relevance of the publication of negative results in order to illustrate such observations in in vitro angiogenesis studies. The fact that cultivated endothelial cells may turn out to be non-angiogenic despite application of a proangiogenic growth medium must be taken into account when performing angiogenesis in vitro- studies. The establishment of universal markers could enable a differentiation between angiogenic and anti-angiogenic endothelial cells.