Development of a platform technology for enhanced endo/lysosomal escape of targeted toxins by structurally specific oleanane saponins

Abstract

Targeted toxins are protein-based therapeutics under investigation for their usage in targeted tumor therapies. They are composed of a toxic enzyme, such as the ribosome-inactivating protein (RIP) saporin, and a targeting ligand, such as growth factors or monoclonal antibodies. After specific binding to target cells and subsequent internalization, their efficacy is dramatically reduced by their accumulation and degradation in the lysosomes. Certain structurally specific oleanane saponins (a subclass of triterpenoidal saponins) that specifically augment the endo/lysosomal escape of particular RIPs may be of great help to circumvent this limiting step. The main objective of this work was the establishment of a platform technology for the enhanced endo/lysosomal escape of targeted toxins, in order to increase their efficacy and concomitantly reduce dosages, side effects and adverse immune reactions in patients. The platform technology was developed by constructing targeted toxins consisting of saporin and different therapeutic monoclonal antibodies. In this system, the ligand of the saporin-based targeted toxins can be exchanged depending on the target cell type, and the synergistic principle between saporin and oleanane saponins can be simultaneously exploited to achieve tremendous cytotoxicity augmentation effects. As a first step, the membrane permeabilizing effects of saponins were studied on different biological membranes. Saponins showed permeabilizing effects on cellular and lysosomal membranes at concentrations of 6 µM and higher and hemolysis at 3 µM and higher. The specific endo/lysosomal escape of targeted toxins is not based on these unspecific membrane permeabilizing effects of saponins and occurs at lower concentrations. To develop the platform technology, two immunotoxins were created by cross-linking the therapeutic antibodies Trastuzumab and Cetuximab to saporin. It was demonstrated that the immunotoxins deliver their toxic payload into the target cells and trigger the antibody-dependent cell- mediated cytotoxicity (ADCC). Immunotoxins preserved the advantages of the naked monoclonal antibodies while, most importantly, their direct cytotoxicity was drastically augmented in combination with saponins achieving death of all cells down to concentrations of 0.001 nM. The platform was validated by the analysis of three further immunotoxins consisting of saporin and the monoclonal antibodies Rituximab, anti-CD22 and anti-CD25. The cytotoxicity of the three immunotoxins was also augmented in the presence of saponins (150-, 19- and 26,000-fold, respectively). The present work opens up numerous vistas for exploiting the presented platform technology. The platform for the enhanced endo/lysosomal escape of targeted toxins may serve as a basis for the treatment of a variety of diseases and may help to achieve more efficient and successful treatments of solid tumors and hematologic malignances.

Zielgerichtete Toxine sind proteinbasierte Therapeutika, die im Hinblick auf ihre Anwendung in der zielgerichteten Tumortherapie erforscht werden. Sie bestehen aus einem toxischen Enzym, zum Beispiel einem Ribosomen inaktivierenden Protein (RIP) wie Saporin, und einem Liganden, wie einem monoklonalen Antikörper. Nach spezifischer Bindung an die Zielzellen und anschließender Internalisierung wird ihre Effektivität aufgrund ihrer Akkumulation und Degradation in den Lysosomen dramatisch verringert. Bestimmte strukturspezifische oleanane Saponine (eine Subklasse von triterpenoiden Saponinen), welche spezifisch die endo/lysosomale Freisetzung von gewissen RIPs verstärken, können dabei helfen, diese limitierenden Schritte zu umgehen. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Etablierung einer Plattformtechnologie zur verstärkten endo/lysosomalen Freisetzung von zielgerichteten Toxinen, um deren Effektivität zu erhöhen und gleichzeitig Dosis, Nebeneffekte und nachteilige Immunreaktionen am Patienten zu verringern. Die Plattformtechnologie wurde durch die Herstellung von zielgerichteten Toxinen, basierend auf Saporin und unterschiedlichen therapeutischen Antikörpern, entwickelt. In diesem System kann der Ligand der Saporin basierten, zielgerichteten Toxine je nach Zielzelltyp ausgetauscht werden. Das synergistische Prinzip zwischen Saporin und den oleananen Saponinen kann simultan genutzt werden, um eine deutliche Verstärkung der Zytotoxizität zu erreichen. Zunächst wurde der membranpermeabilisierende Effekt der Saponine auf unterschiedlichen biologischen Membranen evaluiert. Die Saponine zeigten bei Konzentrationen ab 6 µM einen permeabilisierenden Effekt auf zelluläre und lysosomale Membranen. Die spezifische endo/lysosomale Freisetzung von zielgerichteten Toxinen basiert nicht auf diesem unspezifischen, membranpermeabilisierenden Effekt der Saponine, sondern geschieht bereits bei niedrigeren, nicht lytischen Konzentrationen. Um die Plattformtechnologie zu entwickeln, wurden zwei Immunotoxine durch chemische Kopplung von Saporin mit den therapeutischen Antikörpern Trastuzumab bzw. Cetuximab konstruiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Immuntoxine ihren toxischen Gehalt in die Zielzellen einbringen und die antikörperabhängige, zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) auslösen. Die Immuntoxine behielten die Vorteile des reinen monoklonalen Antikörpers bei, während die Zytotoxizität in Kombination mit Saponinen drastisch erhöht werden konnte und der Tod aller Zellen schon bei Konzentrationen von 0,001 nM eintrat. Die Plattformtechnologie wurde durch die Analyse von drei weiteren Immuntoxinen bestehend aus Saporin und den monoklonalen Antikörpern Rituximab, anti-CD22 und anti-CD25 validiert. Die vorliegende Arbeit eröffnet eine Vielzahl neuer Perspektiven, um die hier präsentierte Plattformtechnologie nutzen zu können. Die Plattformtechnologie könnte helfen, solide Tumorformen und leukämische Krebsformen effizienter und erfolgreicher zu behandeln.