dc.contributor.author
Mühlinghaus, Uta Julia Barbara Gwendolin
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:06:12Z
dc.date.available
2006-01-10T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/3408
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-7608
dc.description
INHALTSVERZEICHNIS
Deckblatt \- Impressum
persönlicher Dank
1 Inhaltsverzeichnis 5
2 Einleitung 9
3 Schrifttum 10
4 Material und Methoden 24
5 Ergebnisse 43
6 Diskussion 75
7 Zusammenfassung 89
8 Summary 92
9 Referenzen 31
10
Abkürzungsverzeichnis
107
11 Publikationen und Kongressbeiträge 111
12 Danksagung 114
13 Lebenslauf 115
14 Erklärung 116
dc.description.abstract
### Expression und Regulation von CXCR3 und CXCR4 während der terminalen
B-Zelldifferenzierung
B-Zellen können nach Antigenkontakt in sekundär lymphatischen Organen weiter
zu Plamazellvorläufern differenzieren. Ein Teil der entstandenen Plasmablasten
kann später im Knochenmark oder entzündetem Gewebe akkumulieren. Bei der Maus
spielt der Chemokinrezeptor CXCR4 eine wichtige Rolle bei der Akkumulation der
Plasmablasten im Knochenmark. Die Liganden von CXCR3 werden in entzündetem
Gewebe gebildet und können Plasmablasten dorthin dirigieren.
In dieser Arbeit wurde die Expression und Regulation der Chemokinrezeptoren
CXCR3 und CXCR4 während der Ausdifferenzierung von humanen Gedächtnis-B-Zellen
zu Plasmazellen sowie deren Expression auf B-Zellpopulationen verschiedener
lymphatischer Organe analysiert. B-Zellen wurden über das Oberflächenmolekül
CD19 definiert, Gedächtnis-B-Zellen konnten über die Expression von CD27 von
den naiven B-Zellen abgegrenzt werden. Plasmablasten und Plasmazellen sind
CD19(+)/CD38(++)/CD20(-). Es konnte durchflusszytometrisch in mehr als zehn
Experimenten gezeigt werden, dass CXCR3 nicht von naiven B-Zellen, jedoch von
einem Teil der Gedächtnis-B-Zellen exprimiert wird. CXCR4 wird von der
Mehrheit aller B-Zellen des Bluts ausgeprägt. Eine genauere Analyse der
CXCR3-ausprägenden Gedächtnis-B-Zellen ergab in mehr als zehn Experimenten
verglichen mit z.B. IgG2 eine signifikante Assoziation der Co-Expression von
CXCR3 mit IgG1 (p<0,0001), welche für CXCR4 nicht feststellbar war. In sieben
Exprimenten exprimierten die meisten Plasmablasten im Knochenmark CXCR4,
während CXCR3 fast nur auf Plasmablasten in Blut von elf Spendern und
entzündeten sekundär lymphatischen Organen - wie an acht Tonsillen und an der
Schleimhaut des Darms von drei Proben getestet - ausgeprägt wird. Dieses
Expressionsmuster lässt vermuten, dass beim Menschen CXCR4 bzw. CXCR3
ebenfalls am Homing in Knochenmark respektive entzündetes Gewebe beteiligt
sind. Um die Regulation der CXCR3- bzw. CXCR4-Expression während der
Differenzierung von Gedächtnis-B-Zellen zu analysieren, wurden humane B-Zellen
in vitro mit unterschiedlichen Methoden T-Zell-abhängig und T-Zell-unabhängig
zu Plasmablasten stimuliert. Dazu wurden über magnetisch-assoziierte
Zellsortierung B-Zellen zu >98 % aufgereinigt und in > 25 Experimenten mit der
konstitutiv CD40L-exprimierenden T-Zelllinie EL4B5 für drei Tage in
Anwesenheit von rekombinatem IL-2 und IL-10 co-kultiviert. Anschließend wurden
die EL4B5-Zellen entfernt und die B-Zellen für fünf weitere Tage mit IL-2 und
IL-10 zu Zellen mit dem Plasmazellphänotyp CD38(++)/CD20(-) weiter stimuliert.
Die Antikörpersekretion wurde im ELISpot-Assay überprüft. Die
durchflusszytometrische Analyse der CXCR3- und CXCR4-Expression erfolgte am
dritten und achten Tag der Kultur. Mit Staphylococcuc aureus Cowan I und CpG
2006 konnten B-Zellen in Anwesenheit von IL-2 und IL-10 T-Zell-unabhängig über
den B-Zellrezeptor respektive Toll-like-receptor 9 zu Antikörper-
sezernierenden Zellen aktiviert werden. Für die Analyse der Regulation von
CXCR3 wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten inflammatorische sowie Th1- und
Th2-Zytokine zugefügt.
B-Zellen regulierten die Expression von CXCR3 hoch, wenn sie mit dem
Th1-Zytokin IFN-g während der ersten drei Tage der Aktivierung co-stimuliert
wurden, dies konnte in acht Experimenten nach Aktivierung mit EL4B5-Zellen und
in fünf Experimenten nach CpG-Stimulation gezeigt werden. In vivo befinden
sich die B-Zellen während dieser frühen Phase der Aktivierung co-lokalisiert
mit den T-Zellen innerhalb eines Lymphknotens. Mit der Zugabe des Th2-Zytokins
IL-4 sowie mit verschiedenen inflammatorischen Interleukinen konnte die
Expression von CXCR3 nicht beeinflusst werden. In sechs parallel
durchgeführten Chemotaxis-Assays konnte gezeigt werden, dass mit der Zugabe
von IFN-g in Assoziation mit der CXCR3-Expression auch die Frequenz der gegen
den CXCR3 Liganden CXCL9 migrierenden Zellen signifikant anstieg (p<0,0313).
Ist CXCR3 bereits auf den Gedächtnis-B-Zellen exprimiert, konnte in fünf
Experimten gezeigt werden, dass dieser Rezeptor unabhängig von der Co-
Stimulation mit IFN-g auch auf späteren Differenzierungsstadien auf der
Oberfläche nachweisbar bleibt.
Daraus lässt sich folgendes Modell der Plasmazellmigration ableiten. IFN-g
bildende Th1-Zellen können die Expression von CXCR3 auf mit ihnen
interagierenden B-Zellen induzieren, welche zu CXCR3-ausprägenden
Plasmablasten differenzieren. Die im entzündeten Gewebe gebildeten Liganden
von CXCR3 locken die entstandenen CXCR3-exprimierenden Plasmablasten an und
führen zur im entzündeten Gewebe beschriebenen Akkumulation von Plasmablasten.
Möglicherweise ist IFN-g auch an einem Klassenwechsel zu IgG1 beteiligt, eine
genaue Zuordnung von Zytokinen zu bestimmten Antikörpersubklassen wie bei der
Maus ist jedoch beim Menschen noch nicht bekannt. Das Homing von Plasmablasten
ins Knochenmark ist ein T-Zell-abhängiges Geschehen. Da das Ausdifferenzieren
von CXCR4(-)-B-Zellen aber in mehr als drei Experimenten unabhängig von der
Art der Aktivierung mit dem Hochregulieren der Expression dieses
Chemokinrezeptors verbunden war, ist die Expression von CXCR4 kein T-Zell-
abhängiges Phänomen. Trotz der tragenden Rolle von CXCR4 an der Akkumulation
im Knochenmark, deuten diese Resultate darauf hin, dass das Akkumulieren im
Knochenmark nicht ausschließlich über die Expression von CXCR4 reguliert ist.
Während für die Expression von CXCR4 kein regulierender Faktor identifiziert
werden konnte, wurde analysiert, dass die Induktion von CXCR3 präzise
reguliert ist. Die Identifikation von IFN-g als induzierenden Faktor für CXCR3
und dessen korrespondierende Liganden führt zu einem besseren Verständnis der
Akkumulation von Plasmablasten und Plasmazellen in chronisch entzündetem
Gewebe. Langfristig könnte diese eventuell medikamentös inhibiert werden und
so als Therapie von Autoimmunkrankheiten wie dem systemischen Lupus
erythematodes oder der rheumatoiden Arthritis eingesetzt werden.
de
dc.description.abstract
### Regulation of CXCR3 and CXCR4 expression during terminal differentiation
of memory B cells into plasma cells
During antigenic stimulation at non-mucosal sites, the formation of plasma
cells takes place in secondary lymphoid tissues. Later, a fraction of these
cells can accumulate in bone marrow or inflamed tissues. In mice expression of
CXCR4 is important for plasma cell accumulation in the bone marrow. Ligands
for CXCR3 are expressed in inflamed tissues and can mediate plasma cell homing
to those sites.
In this study the expression and regulation of the chemokine receptors CXCR3
and CXCR4 during terminal differentiation of human memory B cells into plasma
cells was analyzed.
B cells were defined as CD19 positive cells. Memory B cells could be
distinguished from naïve B cells by the expression of CD27. Plasmablast and
plasma cells are CD38(++)/CD20(-). By flow cytometry it could be shown in more
than ten experiments that CXCR3 is absent on naive B cells, but is expressed
on a fraction of memory B cells. CXCR4 is expressed by the great majority of
all B cells. To specify the CXCR3 expressing memory B cells in more than 10
experiments a significant correlation of the co-expression of CXCR3 and IgG1
could be shown which was absent in the case of CXCR4. In six samples the
greater part of bone marrow plasmablasts expressed CXCR4, whereas CXCR3 was
mainly expressed on plasmablasts of blood of eleven donors and inflamed
secondary lymphoid organs like in seven tonsils and three samples of inflamed
mucosa of the gut. These expression pattern leads to the assumption that in
humans CXCR4 and CXCR3 are also involved in homing into the bone marrow or
inflamed tissue, respectively. To analyse the regulation of the expression of
CXCR3 and CXCR4 during differentiation of memory B cells, human B cells were T
dependently and T independently activated into plasma blasts with various
methods. Therefore purified B cells were co-cultured with the constitutively
CD40L expressing cell line EL4B5 in the presence of IL-2 and IL-10. After
three days the EL4B5 cells were depleted and the B cells further cultured for
five more days with IL-2 and IL-10 by reaching the plasma cell phenotype
CD38(++)/CD20(-). Secretion of antibodies was tested in ELISpot assay. The
expression of CXCR3 and CXCR4 was studied on day 3 and day 8. B cells were
activated T independently by Staphylococcus aureus Cowan I or CpG 2006 by
triggering the B cell receptor or toll-like receptor 9, respectively. For the
analysis of the regulation of CXCR3 inflammatory as well as Th1 and Th2
derived cytokines were added at various time points. In 13 experiments it
could be shown that B cells up-regulated CXCR3 when co-stimulated with the Th1
cytokine IFN-g during the first three days of culture. In the course of an
immune response in vivo, before day 3 after antigenic challenge, B cells are
found in the lymph nodes adjacent to T helper cells. The addition of the Th2
cytokine IL-4 as well as various inflammatory cytokines did not alter the
frequency of CXCR3 expressing cells. In correlation IFN-g could also enhance
the frequency of migrating plasma blast towards the CXCR3 ligand CXCL9 shown
insix chemotaxis assays . During their differentiation into plasma cells, five
experiments showed that CXCR3(+) and CXCR3(-) memory B cells remained stable
in the expression of this receptor. Indicating that once induced in memory B
cells, CXCR3-Expression remains part of the individual cellular memory. The
results presented in this study suggest that the following scenario is at
least one mechanism leading to the accumulation of plasma cells within
inflamed tissues. Th1 cells can stimulate activated B cells specific for the
same antigen to express CXCR3, thus supporting their accumulation within the
adjacent inflamed tissue (Fig.24). Plasma cell homing to bone marrow is a
specific feature of T-dependent immune responses. As it could be shown in more
than three experiments that differentiation of CXCR4(-) B cells is generally
accompanied with the expression of this chemokine receptor, the expression of
CXCR4 is not a T dependent phenomenon. Although CXCR4 is crucially involved in
accumulation of plasma blasts in the bone marrow, these results indicate that
the accumulation is not modulated about CXCR4, exclusively. Whereas there was
no regulatory factor found for the expression of CXCR4, CXCR3-Expression was
induced, precisely. The identification of IFN-g as an inducing factor for
expression of CXCR3 and it s ligands leads to better understanding of the
accumulation of plasma cells in chronically inflamed tissue. On the long run
this migration could be inhibited and function as therapy for autoimmune
diseases as systemic lupus erythematosus or rheumatoid arthritis.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
chemokine receptors
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Expression und Regulation von CXCR3 und CXCR4 während der terminalen
B-Zelldifferenzierung
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. L. H. Wieler
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. F. Hiepe
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. J. Plendl
dc.date.accepted
2005-06-27
dc.date.embargoEnd
2006-01-11
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2006000103
dc.title.translated
Regulation of CXCR3 and CXCR4 expression during terminal differentiation of
memory B cells into plasma cells
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001885
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2006/10/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001885
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open access