Rezellularisierung perfusionsdezellularisierter Lebermatrices mit Langerhans-Inseln im Rattenmodell

Abstract

Diabetes mellitus Typ 1, Gendefekte und Erkrankungen des exokrinen Pankreas führen über den Untergang oder die Funktionsstörung der Langerhans-Inseln zu einem absoluten Insulinmangel und machen eine lebenslange Insulinsubstitution notwendig. Trotz optimaler Substitutionstherapie drohen akute glykämische Entgleisungen und diabetische Spätkomplikationen. Die isolierte Inselzell- Transplantation über die Pfortader stellt einen innovativen Therapieansatz dar, führt jedoch aufgrund von Thrombosierungen häufig zum Untergang der transplantierten Zellen. Deswegen wird die Verwendung alternativer Trägermedien diskutiert. Die Perfusionsdezellularisierung bietet ein Verfahren, aus ganzen Organen nichtimmunogene Matrices herzustellen, deren extrazelluläre Architektur jedoch erhalten ist. Die Leber bietet zudem den Vorteil von drei möglichen afferenten Rezellularisierungswegen. Sie könnte als Grundlage für ein implantierbares Neo- Organ dienen. Um auf diese Weise eine womöglich längere Insulinfreiheit zu gewährleisten, wurde in der vorliegenden Arbeit ein experimenteller Ansatz versucht, in dem Langerhans-Inseln in das Parenchym dezellularisierter Rattenlebern überführt wurden. Es wurde zunächst ein Protokoll zur Perfusionsdezellularisierung von Rattenlebern etabliert. Hierzu wurden unter undulierenden Druckverhältnissen in einem Bioreaktor die Organe bei einem konstanten Perfusionsdruck von 100mmHg über die Arteria hepatica propria mit 1% SDS und 1% Triton-X-100 perfundiert. Der Dezellularisierungserfolg wurde histologisch mittels HE-, Pikrosiriusrot- und Alcianblau-PAS-Färbung, immunhistochemisch mit Nachweis von Collagen IV, Fibronectin und Laminin und quantitativen biochemischen Analysen von DNA-, sGAG- und SDS-Gehalt beurteilt. Anschließend wurden Inselzellen aus Rattenpankreata isoliert und in die gewonnenen Matrices über die Pfortader oder alternativ über den Gallengang infundiert. Die histologischen Verteilungsmuster wurden anschließend nach HE- und AZAN-Färbungen miteinander verglichen. Das durchgeführte Dezellularisierungssprotokoll führte zu einer zufriedenstellenden Dezellularisierung. Histologisch zeigten sich keine verbliebenen Zellen bei erhaltener Extrazellulärmatrixarchitektur. Immunhistochemisch konnte nachgewiesen werden, dass die molekularen Matrixbestandteile erhalten blieben. Biochemisch kam es adäquat zu einem Abfall des DNA-Gehaltes und einem Anstieg des sGAG-Gehaltes bei vorhandenen SDS-Residuen. Die Inselzellinfusion über den Gallengang führte zu histologisch nachweisbaren Inselzellen im Parenchym und damit zu einer freien Verteilung der Langerhans-Inseln innerhalb der dezellularisierten Lebermatrix. Es ist gelungen, Langerhans-Inseln in das Parenchym einer dezellularisierten Rattenleber zu verbringen. Die Inselzellen befinden sich somit in einer physiologischen Extrazellulärmatrix, die über afferente und efferente Blutgefäße versorgt werden kann. So können in weiteren in-vitro-Versuchen die Viabilität und Funktion der infundierten Inselzellen untersucht werden. Perspektivisch eröffnet sich die Möglichkeit von in-vivo-Versuchen, in denen die Auswirkungen einer Implantation eines solchen Neo-Organs auf den Glucosestoffwechsel diabetischer Empfänger untersucht werden.

Patients with loss or failure of pancreatic islets of Langerhans require life-long treatment with insulin for survival and despite receiving optimal state of the art therapy, they are still at risk of suffering potentially lethal acute glycemic events or long-term complications of diabetes. One of several relatively new approaches regarding this issue is the transplantation of isolated islets into the recipient's portal vein. However, due to thrombotic events and subsequent loss of the transplanted islets long-term insulin independence is rarely reached. Perfusion decellularization generates non-immunogenic extracellular matrices of whole organs. A decellularized liver scaffold comes with three vascular systems and could serve as the basic structure of an implantable neo-organ, containing islets that might grant long-term insulin independence. This study is an attempt to transport isolated islets of Langerhans into the parenchymatous tissue of a decellularized rat liver. At first, a protocol for perfusion decellularization of rat livers was established using oscillating pressure conditions within a bioreactor and applying a constant perfusion pressure of 100mmHg on the hepatic artery. Perfusion was carried out using 1% SDS and 1% Triton-X-100 solution. The decellularization outcome was assessed by histological stainings, immunohistochemistry and biochemical analysis. Secondly, rat islets were isolated and infused into the liver scaffolds using two different routes: via the portal vein and via the hepatic duct. Afterwards their distribution was assessed histologically using H&E and AZAN stainings. The utilized protocol led to a satisfactory decellularization. Histological stains showed no remaining cells within a structurally intact extracellular environment. Immunohistochemical stains indicated that the molecular components of the extracellular matrix had been preserved. Biochemical analysis showed an adequate decrease of DNA content while sGAG contents increased and SDS remained detectable. The islet infusion via the hepatic duct led to histologically visible islets within the parenchyma and therefore to an unrestricted distribution inside the decellularized liver scaffold. Islets of Langerhans were successfully transported inside the parenchyma of a decellularized rat liver. It fits a physiological environment with extracellular matrix components with afferent and efferent blood vessels. Thus, further in vitro studies can be performed studying the viability and function of the infused islets. Subsequent in vivo studies could be possible in order to assess the effect of an implantation of such a neo-organ on the glucose metabolism of diabetic animals.