Novel oblique plane microscopes for whole-brain imaging of danionins

Abstract

The ability to simultaneously monitor the neural activity distributed throughout the entire brain would enable scientists to address complex questions related to how neural activity is organized across neural circuits. Optical imaging with the help of genetically encoded calcium sensors promises to bring this goal within reach, but the optical access is limited by scattering of the biological tissue and optical engineering constraints. Fortunately, non-human animal models such as Danionella translucida (DT) and the larval or juvenile Danio Rerio (zebrafish) are small and transparent throughout their life. Optical imaging studies of these organisms therefore are ideally suited to monitor brain-wide neural activity. However, existing microscopy systems do not take full advantage of the potential of these animal models, which would demand an optimized trade-off between resolution, speed, and field of view (FOV). Oblique plane microscopy (OPM) is a technique that potentially is able to overcome these limitations. So far, these techniques have relied on the use of high numerical aperture (NA) detection objective lenses, limiting their FOV to around 1 mm x 1 mm, which is too small to accommodate the nervous system of juvenile zebrafish or the brain of adult DT. I addressed this limitation by designing, building and characterising a family of new OPM variants, diffractive oblique plane microscopy (DOPM) and image transfer oblique plane microscope (IOPM), which have a significantly larger FOV. They operate at low and inter- mediate NA therefore achieve a FOV of 3.3 mm × 3.0 mm × 1.0 mm and 2 mm x 1.4 mm x 1 mm, respectively. I show that DOPM can be used to image the whole nervous system of a juvenile zebrafish at 1Hz and it allows us to extract neural signals from large parts of its brain. Furthermore I show that IOPM is able to simultaneously record neural activity throughout the whole brain of an adult DT at 1Hz and allows us to map out features of the whole auditory pathway of DT. The resulting ability to simultaneously record neural activity throughout the whole brain of juvenile zebrafish and the adult DT at an unprecedented speed will enable us to advance our understanding of the functioning of brain-wide circuits and the complex interplay of different brain areas in vertebrates.

Die gleichzeitige Messung neuronaler Aktivität von Nervenzellen im ganzen Gehirn oder Nervensystem würde es ermöglichen Eigenschaften und Dynamik von ausgedehnteren neuronalen Netzwerken zu untersuchen. Optische Messung neuronaler Aktivität mit Hilfe von genetisch expremierten Kalziumindikatoren ist hier eine attrakive Methode, da sie erlaubt Neuronen in einem größerem Bereich aufzunehmen. Allerdings ist dieser Bereich durch Lichtstreuung im Gewebe und technische Limitierungen begrenzt. In Tiermodellen, wie Zebrabärblingslarven, juvenilen Zebrabärblingen (Danio Rerio) und Danionella translucida (DT), ist die Messung gehirnweiter neuronaler Aktivität mittels optischer Methoden prinzipiell dennoch möglich, da diese klein und transparent sind. Allerdings erlauben es gegenwärtig existierende Mikroskope nicht die Vorteile dieser Tiermodelle auszuschöpfen, da dies ein optimiertes Ausbalancieren von Auflösung, Aufnahmerate und Sichtfeld erfordert. Einzelobjektiv-Lichtblattmikroskopie (engl. Oblique Plane Microscopy, OPM) ist eine Mikroskopietechnik, die potentiell dazu geeignet ist dies zu leisten. Allerdings war diese Technik bisher auf die Nutzung eines Objektivs mit hoher numerischer Apertur (NA) angewiesen. Dies begrenzte ihr Sichtfeld auf einen Durchmesser von ca. 1mm, welches kleiner als das ganze Nervensystem eines juvenile Zebrafischbärblings oder das Gehirn von DT ist. Im Rahmen dieser Arbeit entwickelte ich daher eine Familie von Einzelobjektiv-Lichtblattmikroskopen, die dieser Beschränkung nicht unterliegen. Diffractive Oblique Plane Microscopy (DOPM) und Image Transfer Oblique Plane Microscopy (IOPM) operieren bei niedriger und mittlerer numerischer Apertur und sind daher in der Lage innerhalb eines Sichtfelds von 3.3 mm × 3.0 mm × 1.0 mm und 2 mm x 1.4 mm x 1 mm (XYZ) abbzubilden. Ich zeige, dass DOPM in der Lage ist das gesamte Nervensystem eins juvenilen Zebrafischbärblings mit der Rate von einem 1Hz aufzunehmen und es erlaubt neuronale Aktivität von großen Teilen des Gehirns zu messen. Weiterhin zeige ich, dass IOPM es ermöglicht simultan neuronale Aktivität im ganzen Gehirn einer ausgewachsenen DT aufzunehmen und es somit erlaubt Charakterstika des gesamten auditorischen Systems zu ermitteln. Die aus diesen Entwicklungen resultierende Möglichkeit, gehirnweite neuronale Aktivität von juvenilen Zebrafischbärblingen und ausgewachsenen DT mit hoher Geschwindigkeit zu messen, wird es ermöglichen neue Einsichten in die Funktionsweise von gehirnweiten neuronalen Netzen und dem Zusammenwirken unterschiedlicher Gehirnareale zu ermöglichen.