Regulation of the proto-oncogene ERG by microRNAs and the role of microRNAs in the distinct ETP-ALL subgroup of T-ALL

Abstract

Acute leukemias are a complex heterogeneous group of disorders that differ with regard to biology, clinical course, and prognosis. Over the past years the knowledge of these hematological malignancies has increased, which has resulted in a classification based on morphology, immunophenotype, molecular and clinical features. Aberrant expression of genes in acute leukemia, such as the ETS transcription factor ERG, involved in normal hematopoiesis, has been shown to be independent risk factor predicting inferior outcome in T-ALL and CN-AML. The underlying biology of the oncogenic properties of ERG and its expression regulation remain unknown. Thus, we examined the regulation of ERG by miRNAs, and showed that miR-196a and miR-196b downregulated ERG expression on mRNA level. High expression of these miRNAs was associated with NPM1 mutations in AML, and with an immature phenotype, and myeloid markers in T-ALL. Thus, these results implicate a potential role for miR-196a and miR- 196b in acute leukemia. Recently, a new subgroup of T-ALL, termed ETP-ALL, was identified and was shown to be associated with stem cell and myeloid characteristics and poor prognosis in pediatric T-ALL, which makes this subgroup of biological and clinical relevance. Therefore, we assessed molecular alterations as well as the clinical outcome in a large cohort of adult ETP-ALL in comparison to non-ETP T-ALL patients. High rates of FLT3 mutations were observed in ETP-ALL. Interestingly, FLT3 mutated ETP-ALL was identified as a molecular distinct leukemic subgroup characterized by a specific immunophenotype, a distinct gene expression pattern (aberrant expression of IGFBP7, WT1, GATA3) and mutational status (lack of NOTCH1 mutations and low frequency of clonal TCR rearrangements). With respect to clinical course of these high-risk patients, ETP-ALL patients undergoing allogeneic stem cell transplantation showed an encouraging overall survival. To further explore and underscore the efficacy of targeted therapies, we demonstrate that T-ALL cell lines transfected with FLT3-ITD expression constructs were particularly sensitive to tyrosine kinase inhibitors. In conclusion, ETP-ALL with FLT3 mutations defines a molecular distinct stem cell like leukemic subtype. These data warrant the implementation of a specific treatment with FLT3 inhibitors in addition to early allogeneic stem cell transplantation for this high-risk subgroup. Apart from the genetic alterations of molecular markers, miRNAs, which are post-transcriptional regulators of genes, have been proposed to have crucial impact on the pathogenesis of acute leukemia. In this study, we further investigated the global expression of miRNAs in ETP-ALL. The miRNA profiling revealed miR-221 and miR-222 as the most upregulated and six miRNAs (miR-151-3p, miR-19a, miR- 20b, miR-342-3p, miR-363, miR-576-3p) as downregulated in ETP-ALL compared to non-ETP T-ALL. The expression of miR-221, miR-222, miR-19a, miR-363 was validated in a larger cohort of T-ALL patient samples. ETS1, downregulated in ETP-ALL, was identified as direct target of miR-222. Furthermore, in our in vitro studies miR-222 significantly inhibited proliferation, and caused cell cycle arrest and apoptosis in leukemic cells, implicating a role for miR-222 in the leukemogenesis by altering expression of the proto-oncogene ETS1 in acute leukemia. In conclusion, aberrantly expressed miRNAs, with a functional role in acute leukemia was identified. These findings may serve as useful resource for future studies and aid in development of novel therapeutic targets to improve the treatment of leukemia patients.

Akute Leukämien stellen sehr heterogene Erkrankungen dar. In den letzten Jahren ist es möglich geworden akute Leukämien basierend auf morphologischen, immunologischen, molekularbiologische und zytogenetische Eigenschaften besser zu klassifizieren. Dies ermöglicht eine Therapieoptimierung von Leukämie Patienten. Es konnte gezeigt werden, dass die aberrante Expression von Genen als molekulare Prognosemarker dienen können und diese erklären teilweise auch die zugrundeliegende pathogenetischen Mechanismen von akuten Leukämien. Für den ETS Transkriptionsfaktor ERG, der an der Regulation der linienspezifischen Differenzierung von hämatopoetischen Progenitorzellen beteiligt ist, wurde gezeigt, dass er mit einer ungünstigen Prognose in CN-AML und T-ALL assoziiert ist und einen neuen molekularen Risikofaktor für Leukämie Patienten darstellt. Untersuchungen zur Expressionregulation von ERG konnten zeigen, dass ERG teilweise durch epigenetische Mechanismen reguliert ist. In der vorliegenden Arbeit ist die Regulation von ERG durch microRNAs untersucht worden. Die Überexpression von miR-196a und miR-196b führte zu einer Herunterregulation der ERG mRNA Expression in leukämischen Zellen. Eine erhöhte Expression der beiden miRNAs war mit NPM1 Mutationen in der AML, mit einem unreifen Immunophänotyp und der Expression von myeloischen Oberflächenmarkers in T-ALL assoziiert. Zusammfassend kann somit festgestellt werden, dass miR-196a und miR-196b eine mögliche funktionelle Rolle in der Pathogenese der akuten Leukämie darstellt. Weiterhin war die molekulargenetische Charakterisierung einer ETP-ALL Subgruppe der T-ALL durchgeführt. Die ETP-ALL ist eine neue Subgruppe, die sich durch eine spezifische Genexpressionssignatur, einem unreifen Immunophänotyp und durch die Expression von myeloischen Antigenen und/oder Stamzellmarkern auszeichnet. Innerhalb der pädiatrischen T-ALL ist die ETP-ALL mit einer ungünstigen Prognose assoziiert. Deswegen ist die ETP- ALL biologisch wie klinisch von besonderem Interesse. Hier konnte gezeigt werden, dass die ETP-ALL eine hohe Frequenz von FLT3 Mutationen besitzt. Interessanterweise konnte die FLT3 mutierte ETP-ALL als eine molekulargenetisch sehr distinkte ETP-ALL Subgruppe identifiziert werden, die sich durch eine spezifischen Imunophänotyp, Genexpressionsmuster (aberrante Expression von IGFBP7, WT1, GATA3) und Mutationsstatus (eine niedrige Frequenz von NOTCH1 Mutationen und TCR Rearrangement) auszeichnet. Darüber hinaus zeigten ETP-ALL Patienten einen Überlebensvorteil durch eine konsolidierende allogene Stammzelltransplantation im Vergleich zu Patienten die eine alleinige konsolidierende Chemotherapie erhalten haben. Weiterhin wurde die Wirksamkeit von Tyrosinkinase Inhibitioren in der T-ALL geprüft und es konnte gezeigt werden, dass FLT3-transformierten T-ALL Zelllinien eine hohe Sensitivität gegenüber Tyrosinkinase Inhibitoren besitzen. Diese Daten bestätigen die Einführung von spezifischen Behandlungsansätzen mit FLT3 Inhibitoren zusätzlich zur frühen allogenen Stammzelltransplantation für diese Risikogruppe. Darüber hinaus wurde die differentielle Expression von miRNAs in der ETP-ALL untersucht. Die miRNA Expressionsprofile zeigten eine erhöhte Expression von miR-221 und miR-222 und eine verminderte Expression von 6 weiteren miRNAs (miR-151-3p, miR-19a, miR-20b, miR-342-3p, miR-363, miR-576-3p) im Vergleich zur typischen T-ALL. Die Expression von miR-221, miR-222, miR-19a und miR-363 konnte in einer großen Kohorte von T-ALL Patienten validiert werden. Das Gen ETS1, welches in der ETP-ALL niedrig exprimiert ist, konnte als miR-222 Target identifiziert werden. Für die miR-222 konnte weiterhin eine Rolle in der Proliferationshemmung von leukämischen Zellen gezeigt werden; zum Einen durch die Inhibition der S-phase im Zellzyklus und zum Anderen durch die induktion von Apoptose. Zusammenfassend unterstreichen diese Daten, dass die Deregulation von miRNAs eine funktionelle Rolle in der akuten Leukämie spielt und können als Basis für die Entwicklung von miRNA-basierten Therapiestrategien dienen, um die Therapie von Leukämie Patienten zu verbessern.