Adhesion and degranulation-promoting adaptor protein (ADAP) is known to play an important role in indirectly regulating integrins upon T-cell receptor or chemokine receptor stimulation and as a result is crucial for T cell migration and adhesion. ADAP has also been reported to bind to the known actin regulators Ena/VASP and Nck. Here, in this work we show that ADAP interacts with actin directly and induces actin polymerization in vitro. The region responsible for the polymerization activity was narrowed down to the disordered N-terminal 381 residues of ADAP. ADAP also induces bundling of actin filaments in an in vitro co-sedimentation assay. The fragments of ADAP that showed activity in polymerization assays were also active on bundling actin filaments. The formation of filaments and actin fibers by ADAP and various ADAP fragments were confirmed by negative stain electron microscopy showing bundles of distinct sizes and patterns when comparing ADAP_1-381, ADAP-full length and the ADAP/SKAP55 complex. The involvement of the N-terminus of ADAP in actin remodeling was further confirmed in Jurkat T cells where adhesion and migration was seen to be impaired and total F-actin content was significantly reduced upon stimulation in cells expressing ADAP missing its N-terminal region. NMR investigations also confirmed the binding of ADAP to monomeric as well as filamentous actin and provided information about multiple epitopes in the N-terminal 200 residues of ADAP involved in direct interaction with monomeric actin. Further confirmation of these epitopes was obtained from crosslinking mass spectrometry where short ADAP motifs, often enriched in lysine-proline dipeptides were found to bind to all four sub-domains on monomeric actin suggesting a multivalent interaction mode. In contrast, the same ADAP motifs were seen to converge to the actin dimer interface along the axis of the F-actin filament. The enhanced actin polymerization activity of ADAP in the presence of actin binding proteins like profilin (a barbed end actin elongator) and CapZ (a barbed end capping protein) indicate that ADAP polymerizes through the pointed end of the actin filament. However, the addition of cofilin initially leads to enhanced polymerization activity by ADAP followed by strong depolymerization. This suggests that cofilin has an overlapping binding site with ADAP on the filament as also suggested by our docking models. Overall, these results direct towards a novel mechanism of actin polymerization by the intrinsically disordered region of ADAP, which enhances the local concentration of actin by a sponge-like, multivalent mode of interaction that leads to instant polymerization, formation of filaments and actin bundles.
Das Adhäsions- und degranulationsfördernde Adaptorprotein (ADAP) spielt bekanntermaßen eine wichtige Rolle bei der indirekten Regulierung von Integrinen nach Stimulation durch T-Zell-Rezeptoren oder Chemokinrezeptoren und ist daher für die Migration und Adhäsion von T-Zellen entscheidend. Es wurde auch berichtet, dass ADAP an die bekannten Aktinregulatoren Ena/VASP und Nck bindet. In dieser Arbeit zeigen wir, dass ADAP direkt mit Aktin interagiert und in vitro zur Polymerisation von Aktin führt. Die Region, die für die Polymerisationsaktivität verantwortlich ist, wurde auf die ungeordneten N-terminalen 381 Aminosäuren von ADAP eingegrenzt. ADAP induziert auch die Bündelung von Aktinfilamenten in einem in vitro Co-Sedimentationstest. Die Fragmente von ADAP, die in Polymerisationstests Aktivität zeigten, waren auch bei der Bündelung von Aktinfilamenten aktiv. Die Bildung von Filamenten und Aktinfasern durch ADAP und verschiedene ADAP-Fragmente wurde durch Negativ-Stain-Elektronenmikroskopie bestätigt, die beim Vergleich von ADAP_1-381, ADAP in voller Länge und dem ADAP/SKAP55-Komplex Bündel unterschiedlicher Größe und Muster zeigte. Die Beteiligung des N-Terminus von ADAP am Aktin-Remodeling wurde ferner in Jurkat-T-Zellen bestätigt, bei denen eine Beeinträchtigung der Adhäsion und Migration festgestellt wurde und der Gesamt-F-Aktin-Gehalt nach Stimulation in Zellen, die ADAP ohne N-Terminus exprimieren, signifikant reduziert war. NMR-Untersuchungen bestätigten auch die Bindung von ADAP an monomeres und filamentöses Aktin und lieferten Informationen über mehrere Epitope in den N-terminalen 200 Aminosäureresten von ADAP, die an dieser direkten Interaktion beteiligt sind. Eine weitere Bestätigung dieser Epitope lieferte die Crosslinking-Massenspektrometrie, bei der festgestellt wurde, dass kurze ADAP-Motive, die häufig mit Lysin-Prolin-Dipeptiden angereichert sind, an allen vier Subdomänen von monomerem Aktin binden, was auf einen multivalenten Interaktionsmodus schließen lässt. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass dieselben ADAP-Motive entlang der Achse des F-Aktinfilaments an der Schnittstelle der Aktin-Dimere konvergieren. Die verstärkte Aktinpolymerisationsaktivität von ADAP in Gegenwart von Aktinbindungsproteinen wie Profilin (ein Aktinverlängerer) und CapZ (ein Kappenprotein) deutet darauf hin, dass ADAP über das minus-Ende des Aktinfilaments polymerisiert. Die Zugabe von Cofilin führt jedoch zunächst zu einer verstärkten Polymerisationsaktivität von ADAP, gefolgt von einer starken Depolymerisation. Dies deutet darauf hin, dass Cofilin eine überlappende Bindungsstelle mit ADAP auf dem Filament hat, wie auch unsere Docking-Modelle nahelegen. Insgesamt deuten diese Ergebnisse auf einen neuartigen Mechanismus der Aktinpolymerisation durch den intrinsisch ungeordneten Bereich von ADAP hin, der die lokale Aktinkonzentration durch einen schwammartigen, multivalenten Interaktionsmodus erhöht, der zu sofortiger Polymerisation, Bildung von Filamenten und Aktinbündeln führt.
