Transcriptional characterization and functional analysis of long non-coding RNA/protein-coding gene pairs encoded in the human genome

Abstract

Many protein-coding gene (PCG) promoters in the human genome initiate transcription in two directions, thereby expressing an mRNA and an upstream non-coding RNA (ncRNA). Diverse species of these promoter-associated ncRNAs are abundantly detected in genome-wide transcriptome studies but the functions of these non-coding transcripts remain mostly elusive. In this thesis, a set of 1,107 long ncRNA/PCG pairs that are expressed from bidirectional promoters is defined. These bidirectional promoters exhibit a high degree of sequence conservation and mediate linked expression of paired genes. This is determined by expression quantification and reporter assays of selected candidates. Expression of these long ncRNA/PCG pairs is detected to frequently occur from promoters of cancer-related proteins. One of the bidirectional promoters mediates simultaneous expression of the tumor suppressor gene RB1 and ncRNA- RB1 as detected by assaying the effects of retinoblastoma-associated point mutations in a bidirectional reporter assay. The linked expression of both genes is further shown by mutation of core promoter elements residing in both promoter directions. Changes of single or few base-pairs, is found to affect transcription initiation in both promoter directions equally. To determine the functionality of paired genes and their involvement in common biological pathways, ncRNA-RB1 and RB1 mRNA were individually depleted in a cell culture system. This revealed that both genes are not regulating each other’s expression and that ncRNA-RB1 conveys regulatory effects that are different but also to a certain degree overlapping to the RB1 controlled transcriptional program. NcRNA-RB1 positively regulates the expression of calreticulin (CALR), an endoplasmic reticulum-sessile chaperone that can translocate to the surface of tumor cells after chemotherapy, thereby serving as an ’eat-me-signal’ to phagocytes. Knock-down of the nuclear-retained ncRNA-RB1 in tumor cells reduces the expression of the CALR gene on chromatin, impairs translocation of the CALR protein to the cell surface upon treatment with anthracylines, and consequently inhibits uptake of the cells by macrophages. In conclusion, co- transcription of ncRNA-RB1 from the bidirectional RB1 promoter provides a positive link between the regulation of two the tumor suppressors RB1 and CALR. Loss of expression of either gene product of the ncRNA-RB1/RB1 pair entails the abolition of additional tumor-inhibitory mechanisms.

Viele Promotoren Protein-kodierender Gene im menschlichen Genom initiieren die Transkription in zwei Richtungen und exprimieren dabei eine Boten-RNA (mRNA) sowie eine nicht-kodierende RNA (ncRNA), welche upstream des Promoters liegt. Verschiedene Varianten solcher Promoter-assoziierten, ncRNAs wurden kürzlich in Genom-weiten Transkriptionsstudien detektiert. Dennoch sind ihre Funktionen bisher weitgehend ungeklärt. In dieser Doktorarbeit, wird ein Set bestehend aus 1107 Paaren langer ncRNAs (>200 bp) und Protein-kodierender Gene definiert, die von bidirektionellen Promotoren exprimiert werden. Entsprechende Promotoren weisen ein hohes Maß an Sequenzkonservierung auf und initiieren gleichzeitig die Expression von Genpaaren. Durch Quantifizierung der Expression und Verwendung von Reporter Assays für ausgewählte Kandidatengenpaare wurde dieses Verhalten nachgewiesen. Viele dieser bidirektionellen Promotoren exprimieren Gene, die im Zusammenhang zur Entstehung von Tumoren stehen. Einer dieser Promotoren vermittelt die gleichzeitige Expression des Tumorsuppressors RB1 und der ncRNA-RB1. Dieses wird mittels eines Reporter-Assays gezeigt, welcher die Auswirkungen von Retinoblastoma-assoziierten Punktmutationen auf die Bidirektionionalität des Promotors nachvollzieht. Weiterhin wird die gekoppelte Expression der Genpaare durch Mutation von Core-Promoterelementen gezeigt, welche sich in beide Richtungen des bidirektionellen ncRNA-RB1/RB1 Promoters befinden. Dabei beeinflusste die artifizielle Veränderung einzelner oder einiger weniger Basenpaare die Transkriptionsinitiation in beide Promoterrichtungen. Um die Funktionalität beider Gene eines Genpaares sowie ihre Beteiligung in gemeinsamen biologischen Stoffwechselwegen aufzuklären, wurden die ncRNA-RB1 und die RB1 mRNA einzeln inaktiviert. Dieser Versuch zeigte, dass beide Gene nicht gegenseitig ihre Expression beeinflussen und die ncRNA-RB1 regulatorische Effekte besitzt, die unterschiedlich von, andererseits aber auch überlappend mit der transkriptionellen Regulation durch RB1 sind. Unabhängig von RB1 beeinflusst die ncRNA-RB1 die Expression von Calreticulin (CALR), eines Chaperons des endoplasmatischen Retikulums, positiv. Nach Behandlung mit spezifischen Chemotherapeutika kann CALR zur Zelloberfläche von Tumorzellen translozieren und dort als Fress-Signal für phagozytierende Zellen dienen. Der Knock-down der nukleären ncRNA-RB1 in Tumorzellen reduziert die Transkription des CALR-Gens und verhindert nachfolgend die Translokation des CALR-Proteins zur Zelloberfläche als Auswirkung der Behandlung mit Anthracyclinen. Die Konsequenz daraus ist eine verhinderte Aufnahme der ncRNA- RB1 knock-down Zellen durch Makrophagen. Als Ergebnis stellt die gleichzeitige Transkription von ncRNA-RB1 und RB1 von einem gemeinsamen bidirektionalen Promoter eine Verknüpfung zwischen der Regulation der zwei Tumorsuppressoren RB1 und CALR her. Der Verlust der Expression jedes Gens des Paares ncRNA- RB1/RB1 führt zur Beeinträchtigung Tumor unterdrückender Mechanismen in der Zelle.