Stimuli-Sensitive Nanocarriers for Diagnostic and Therapy

Abstract

In this thesis, the overall goal was to develop novel stimuli-responsive nanocarriers which are able to overcome biological barriers and furtherly transport and release various therapeutic cargos to the target site. Furthermore, the aim was to develop a nanomedicine platform that shows the ability to protect the sensitive cargo and use natural stimuli for a controlled release. Besides therapy, the tailor-made nanocarriers are targeted to be adaptable for diagnostic approaches. In the first project of this thesis, a pH degradable dPG-amine nanocarrier for the delivery of genetic material was developed. Due to the introduction of stimuli-responsive acetal groups the nanocarrier could be cleaved at acidic pH values which occur in the endosomal compartments and remained stable at neutral pH which appearrs in the extracellular matrix. Modified benzacetal moieties realized a fine-tune in the cleavage kinetics. The complexation and release of DNA out of nanocarriers was studied by various methods. The pH triggered cleavage of the outer amine shell results in the degradation of the multivalent amine architecture. By that, the ability to bind genetic material is reduced and a controlled release of DNA can occur. In vitro transfection demonstrated that pH cleavable dPG-amines could transfect HeLa cells with GFP-DNA and resulted in cell-compatible cleavage products with a significantly reduced toxicity compared to the non- degradable gold standard PEI. The synthesis of these degradable core-shell polymers realizes a new carrier platform for the complexation and controlled release of genetic material at the target site by the loss of multivalent interactions. Additionally, a novel approach for the synthesis of dendritic polyglycerol based nanogels was developed. The Thiol–Michael nanoprecipitation method which operates under mild conditions and did not require any catalyst or surfactant was used to develop tailor-made nanogels in the size range of 100-1000 nm. The biocompatible nanogels were used for diagnostic as well as therapy for topical skin application. Dye-labeled nanogels were used for the first time as pH-nanosensors to determine the pH of the hair follicle (HF) at different depth in an ex vivo porcine ear model. The non-toxic nanogels showed a high potential for the penetration via the follicular uptake route. An automated analysis of confocal laser scanning microscopy (CLSM) images helped to accurately determine the pH inside the HF. The pH gradient ranged from 6.5 on the skin surface to 7.4 in deeper areas of the HF with a sharp pH increase over the first 300 μm. This finding provides a clear direction for the development of pH responsive DDS for follicular drug delivery. Furthermore, functional nanogel-peptide conjugates were developed which could complex and release hydrophobic drugs into the skin. The conjugation of the tailor-made peptide chains to the polyglycerol based nanogel increased the loading capacity and binding specificity of the targeted therapeutic model drug significantly. Skin penetration tests showed efficient dermal delivery and release of a photosensitizer which can be used for photo-dynamic therapy against cancer. Moreover, cationic nanogels based on dendritic polyglycerol and low molecular weight PEI were used for the delivery of siRNA. The genetic material could be encapsulated by the above-mentioned Thiol-Michael nanoprecipitation. The mild and bioorthogonal reaction enables the in-situ binding of GFP-siRNA into the nanogel matrix. Acetal moieties which were incorporated inside the nanogel realize a pH dependent degradation of the sub-100 nm carrier. In vitro transfection demonstrated that the pH cleavable nanogels could successfully silence GFP processing HeLa cells and were significantly less toxic compared to non-cleavable PEI. The cationic nanogel- platform will be investigated further for the delivery of anti-inflammatory siRNA for topical skin application. Additionally, formation and impact of the protein corona on the dPG-based nanogels with a varied surface charge was analyzed. Here, nanogels with a higher surface charge showed an increased binding of the blood protein human serum albumin (HSA) which resulted in an increased hydrodynamic radius and reduced surface charge. In the future, the nanogel manufacturing process could be upscaled to produce nanocarriers with a standard operation protocol in a one batch procedure to ensure further development to a nanomedicine platform. Recently, nanoparticles were prepared by nanoprecipitation process in a microfluidic device.[219] In general, this technique is used for the production of microparticles[220] which are useful for advanced drug delivery (e.g. the encapsulation of biological cargos like living cells[221]) and may be adapted to produce stimuli responsive nanogels in a continuous process in high quantity. Furthermore, the nanogel-platform could be used to encapsulate various therapeutic proteins or therapeutic hydrophobic drugs. Due to the flexible nanogel size range the application area is widely spread. Smaller nanogels in the sub-100 nm area could be used for the intracellular delivery of encapsulated therapeutic cargo. In contrast, bigger nanogels could be applied to transport their freight into deeper areas of the hair follicle for therapeutic dermal applications. Incorporated stimuli-responsive groups would realize a controlled release and the degradation to biocompatible residues.

Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es neuartige Stimulus empfängliche Nanotransporter zu entwickeln, die biologische Barrieren überwinden und zusätzlich therapeutische Fracht transportieren und freisetzen können. Weiterhin sollte eine nano-medizinische Plattform hergestellt werden, der es möglich ist die sensible Fracht zu schützen und durch natürliche Stimuli kontrolliert am Zielort freizugeben. Neben therapeutischen Aspekten sollen die maßgeschneiderten Nanotransporter auch für diagnostische Ansätze genutzt werden. Im ersten Projekt dieser Thesis wurde ein pH spaltbarer Nanotransporter entwickelt, der genetisches Material befördern kann. Auf Basis der Einführung von Stimulus empfänglichen Acetalgruppen kann der Nanotransporter in saurem pH Milieu gespalten werden. Diese treten in den endosomalen Kompartimenten auf und bleiben bei neutralem pH-Wert, wie er in einer extrazellularen Matrix auftritt, stabil. Modifizierte Benzacetal-gruppen ermöglichen dabei einen Feinschliff der Spaltkinetik. Die Komplexierung und die Freisetzung der DNA aus Nanotransportern wurde mit verschiedenen Ansätzen analysiert. Die pH-getriggerte Spaltung der äußeren Aminschale resultiert in einem Zerfall der multivalenten Amin-Architektur. Aufgrund dessen ist die Fähigkeit der Bindung von genetischen Material reduziert. Dies ermöglicht eine kotrollierte Freisetzung der DNA. Mit Hilfe von in vitro Transfektions-Tests konnte gezeigt werden, dass pH-spaltbare dPG-Amine HeLa Zellen mit GFP-DNA transfizieren können. Die Spaltprodukte des Nanotransporters weisen im Vergleich zum abbauresistenten Goldstandard PEI eine signifikant reduzierte Toxizität auf. Die Synthese dieser spaltbaren Kern-Schale-Polymere ermöglicht eine neue Transportplattform für die Komplexierung sowie kontrollierter Freisetzung von genetischem Material, die durch den Verlust multivalenter Interaktionen genau am Zielort greifen kann. Zusätzlich wurde ein neuer Ansatz für die Synthese von Nanogelen entwickelt, die auf dendritischen Polyglycerin basieren. Die Methode der Thiol-Michael Nanofällung, die unter milden Reaktionsbedingungen durchgeführt wurde, benötigt weder einen Katalysator noch Tenside, um maßgefertigte Nanogele im Größenbereich von 100-1000 nm herzustellen. Die biokompatiblen Nanogele wurden sowohl für die Diagnostik als auch für topische Hautanwendungen benutzt. Zum ersten Mal wurden farbstoffmarkierte Nanogele als pH-Nanonsensoren genutzt, um den pH-Wert von Haarfollikeln (HF) in verschiedenen Tiefen in einem ex vivo Schweineohrmodell zu bestimmen. Die nicht-toxischen Nanogele wiesen ein hohes Potenzial für das Eindringungsvermögen über den follikulären Aufnahmeweg auf. Mit Hilfe einer automatisierten Analyse durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie konnte der pH-Wert innerhalb des HFs genau bestimmt werden. Der pH Gradient erstreckte sich von Werten von 6,5 auf der Hautoberfläche bis hin zu Werten von 7,4 in tieferen Arealen des HFs mit einem starken pH-Anstieg über die ersten 300 µm. Diese Erkenntnis gibt eine klare Richtung für die Entwicklung von pH- responsiven DDS für den follikulären Wirkstofftransport. Weiterhin wurden funktionelle Nanogel-Peptid Konjugate entwickelt, die hydrophobe Wirkstoffe komplexieren und in der Haut freigeben können. Die Konjugation der maßgeschneiderten Peptidketten an Polyglycerin basierten Nanogelen konnte die Ladungskapazität sowie die Bindungsspezifität im anvisierten therapeutischen Modell-wirkstoff signifikant erhöhen. Tests zur Hautpenetration zeigten einen effizienten dermalen Wirkstofftransport sowie die Freigabe eines Photo- Sensibilisators der in der photo-dynamischen Krebstherapie eingesetzt werden kann. Darüber hinaus wurden kationische Nanogele, basierend auf dendritischen Polyglycerin und niedermolekularem PEI, für den Transport von siRNA verwendet. Das genetische Material wurde dabei durch die oben bereits erwähnte Thiol- Michael Reaktion eingekapselt. Die milde, bioorthogonale Reaktion befähigt die in situ Bindung von GFP-siRNA in die Nanogelmatrix. Mittels Acetalgruppen, die in das Nanogel eingebettet wurden, konnte ein pH-abhängiger Abbau der sub-100 nm Träger realisiert werden. Mittels in vitro Transfektion wurde gezeigt, dass pH-spaltbare Nanogele erfolgreich die GFP Bildung von HeLa Zellen unterdrücken können. Zusätzlich zeigten sich diese als weniger toxisch verglichen mit nichtspaltbarem PEI. Die kationische Nanogelplattform wird weiter für den Transport anti-entzündlicher siRNA für topische Hautanwendungen untersucht werden. Zusätzlich wurde die Bildung sowie der Einfluss der Proteinkorona auf dPG-basierte Nanogele mit unterschiedlichen Oberflächenladungen untersucht. Dabei zeigte sich, dass Nanogele mit einer höheren Oberflächenladung eine erhöhte Bindung des Blutproteins Humanalbumin aufweisen. Dies resultierte in einem erhöhten hydrodynamischen Radius sowie einer reduzierten Oberflächenladung des Nanogels. In Zukunft wäre ein Upscale des Herstellungsprozesses von Nanogelen denkbar, um Nanotransporter mittels eines Standardprotokolls in einer ein-Batch Prozedur herzustellen, um die Entwicklung zu einer nanomedizinischen Plattform zu ermöglichen. Erst kürzlich wurden Nanopartikel im Nanofällungsprozess mittels Mikrofluidik hergestellt.[219] Generell wird diese Technik für die Produktion von Mikropartikeln benutzt.[220] Diese sind besonders für die Anwendung des fortgeschrittenen Wirkstofftransports (z.B. die Einkapselung von biologischer Fracht wie lebenden Zellen[221]) nützlich. Außerdem besteht die Möglichkeit dieses Verfahren zu adaptieren, um Stimuli-sensitive Nanogele in einem kontinuierlichen Prozess in hohen Mengen herzustellen. Weiterhin ist es möglich die Nanogelplattform zu nutzen, um verschiedene therapeutische Proteine oder hydrophobe Wirkstoffe einzukapseln. Aufgrund des weiten Größenbereichs der Nanogele ist das Anwendungsspektrum sehr breit. Kleinere Nanogele im sub-100 nm Bereich könnten für den intrazellulären Transport eines eingekapselten therapeutischen Wirkstoffes genutzt werden. Im Gegensatz dazu könnten größere Nanogele dazu genutzt werden, um ihre Fracht in tiefere Areale des Haarfollikels für therapeutische dermale Anwendungen zu transportieren. In das Nanogel eingebaute, Stimuli-sensitive Gruppen würden eine kontrollierte Freigabe und die Zersetzung zu biokompatiblen Abbauprodukten realisieren.