Molekulare Mechanismen der fetalen Programmierung: Erste Einblicke in den Einfluss von plazentarem Klotho auf mütterliche und kindliche biologische Parameter

Abstract

In dieser Arbeit sollte die Rolle von plazentarem Klotho, einem Typ-1 singlepass Transmembranprotein, welches vielfältige Effekte entfaltet und mit der Inhibition von Alterungsprozessen in Zusammenhang gebracht wird, näher charakterisiert werden. Dies geschah unter mehreren Gesichtspunkten. Die Idee zu diesem Projekt entstammte einem bisher nicht publizierten Tierexperiment an Mäusen von Professor Dr. med. Florian Lang (in freundlicher Korrespondenz mit Professor Lang), welcher das Überleben homozygot Klotho-defizienter Nachkommenschaft heterozygot Klotho-defizienter Mütter durch eine während der Schwangerschaft und Stillzeit eingehaltenen Vitamin-D-defizienten Diät drastisch erhöhen konnte. Normalerweise versterben homozygot Klotho-defiziente Mäuse einige Monate nach der Geburt. Diese Beobachtung ließ stattgefundene Effekte von fetaler Programmierung vermuten. Unter fetaler Programmierung versteht man epigenetische Modifikationen im Genom des ungeborenen Kindes, welche durch ein aberrierendes intrauterines Milieu hervorgerufen werden können. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun untersucht werden, ob variierende Konzentrationen von plazentarem Klotho einen Einfluss auf den gebräuchlichsten Parameter der fetalen Programmierung, das Geburtsgewicht, haben. Ferner wurde neben Klotho in dieser Arbeit auch die Konzentration des plazentaren Vitamin-D-Rezeptors bestimmt und Interaktionen zwischen diesem und Klotho untersucht. In gleicher Weise wurden andere plazentare, von weiteren Doktoranden bestimmte Proteine auf Interaktionen mit Klotho analysiert. Die Plazentaproben wurden während des Zeitraums von Januar 2000 bis Dezember 2004 an der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe der Charité Campus Mitte, Universitäts-klinikum der Humboldt- und Freien Universität Berlin, gesammelt. Aus der Kohorte wurden im Rahmen dieser Arbeit 343 Proben zur weiteren Analyse aufgearbeitet. Vier davon erzielten keine verlässlichen Resultate, drei weitere wurden auf Grund unterschiedlicher ethnischer Herkunft ausgeschlossen, womit 336 Proben in die statistische Auswertung eingeschlossen wurden. Mit allen partizipierenden Müttern wurde auch ein strukturiertes Interview durchgeführt, von den Neugeborenen wurden biometrische und klinischen Daten im Rahmen der postnatalen Routineuntersuchung erhoben, etwaige vorhandene Krankenakten ausgewertet und all diese Informationen in eine Datenbank eingebracht. Zur Bestimmung der Proteinkonzentration bediente man sich dem sehr gut etablierten Western Blot Verfahren. Alle Experimente wurden zumindest zweimal wiederholt. Die statistische Auswertung der Daten konnte die Hypothese, wonach eine unterschiedliche Expression von plazentarem Klotho durch Modifikation des intrauterinen Milieus zu programmierenden Effekten beim Neugeborenen führt, nicht bestätigen. Die bestimmten Proteinkonzentrationen von Klotho ließen sich nicht mit Effekten auf das Geburtsgewicht assoziieren. Die Assoziation von Klotho mit anderen plazentaren Proteinen erbrachte mehrere signifikante Resultate. Es konnte demonstriert werden, dass Klotho positiv mit dem Vitamin-D-Rezeptor (r2=0,101; p<0,0001), der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase (r2=0,080; p<0,0001), dem Peroxisom-Proliferator- aktivierten Rezeptor (r2=0,064; p<0,0001) und dem Angiotensin-II-Rezeptor- Typ-2 (r2=0,059; p<0,0001) korreliert. Darüber hinaus konnte ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen positiver Rauchanamnese (p=0,0122), Rauchen während der Schwangerschaft (p=0,013) und einer verringerten plazentaren Expression von Klotho hergestellt werden. Die Anzahl an gerauchten Packyears zeigte ferner eine inverse Korrelation mit plazentarem Klotho (r2= 0,021; p = 0,0091). Die Proteinkonzentration von Klotho korrelierte auch invers mit der eine Woche prä- (r2= 0,176; p = 0,0009) bzw. postnatal (r2= 0,025; p = 0,0042) bestimmten Leukozytenzahl. Aus der vorliegenden Arbeit konnten mehrere Hypothesen generiert werden, die weiterer Forschungsarbeit bedürfen. Es konnten Assoziationen zwischen Klotho und anderen plazentaren Proteinen hergestellt werden, die die Vermutung zulassen, dass Klotho viele seiner putativen Funktionen in der Plazenta in ähnlicher Weise wie im übrigen Organismus ausübt. Zusätzlich konnten weitere, bis dato noch nicht bekannte Assoziationen aufgezeigt werden, wie der negative Einfluss von Rauchen und erhöhter Leukozytenzahl auf die plazentare Expression von Klotho.

Klotho is a singlepass transmembrane protein predominantly expressed in the kidney. However, expression in the placenta was likewise reputed. It is considered as a putative major player in the development of cardiovascular diseases and was inversely associated with aging. The objective of this thesis was to analyze placental Klotho expression and to investigate Klotho in the context of fetal programming. Fetal programming is a constantly emerging field as the intrauterine environment seems to be an important factor for an initial setting of various biological nominal values. Placenta samples were collected at the clinic for gynecology and obstetrics, Charité Campus Mitte. Structured interviews were per-formed with all partaking mothers, postnatal biometric and clinical data of the neonates were collected during the routine postnatal physical examination and existing clinical re-cords were examined. We then analyzed the expression of Klotho and other placental pro-teins by Western Blot in 343 samples. In the placenta Klotho correlated positively with the Vitamin D receptor (r2=0,101; p<0,0001), the endothelial nitric oxide synthase (r2=0,080; p<0,0001), the peroxisome pro-liferator activated receptor-γ (r2=0,064; p<0,0001) and the angiotensin II type 2 receptor (r2=0,059; p<0,0001). In addition placental Klotho could be associated with clinical data gathered during the sample collection: Leukocyte count performed one week before (r2=0,176; p=0,0009) and one week after delivery (r2=0,025; p=0,0042) correlated nega-tively with placental Klotho concentrations. Smoking before (p=0,0122) and during preg-nancy (p=0,013) resulted in lower placental Klotho levels compared to non smoking moth-ers. Furthermore smoked pack years also correlated negatively with placental Klotho con-centrations (r2=0,021; p=0,0091). Variations in placental Klotho expression had no signifi-cant impact on the most commonly used surrogate parameter of fetal programming, birth-weight. In conclusion, we could demonstrate that placental Klotho is part of a complex paracrine network of cardiovascular related proteins. In addition we were able to show associations between smoking status or leukocyte count and altered placental Klotho concentrations. However, in the studied cohort variations in placental Klotho expression did not show an impact on birthweight.