Zytokinabhängige und membranassoziierte Wechselwirkungen zwischen mikrobiell stimulierten Makrophagen und Natürlichen Killer Zellen

Abstract

Die Aktivierung von Makrophagen (MF) durch Interferon (IFN-) g ist ein bedeutender Abschnitt der zellulären Immunreaktion auf Erreger. Die Mechanismen der in vitro Induktion der IFN-g Produktion durch Mikroorganismen sind Thema der vorliegenden Arbeit. In Abwesenheit von T-Lymphozyten wird die Bildung von IFN-g durch zytokinvermittelte Interaktionen zwischen MF und Natürlichen Killer (NK) Zellen initiiert. Allerdings wurde beobachtet, daß a) die IFN-g Produktion abgeschwächt ist, wenn ein Membrankontakt zwischen MF und NK Zellen fehlt und b) in manchen Erregermodellen eine enge Nachbarschaft dieser Zellen für eine IFN-g Produktion sogar unabdingbar ist. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, daß, neben den zytokinvermittelten, auch membranständige Mechanismen an der Induktion von IFN-g beteiligt sind. Es wurde untersucht, ob weitere lösliche MF-Faktoren an der Induktion der IFN-g Produktion beteiligt sind. Während der Koinkubation mit entweder Pneumocystis carinii oder Listeria monocytogenes wurden MF in einem Zweikammernsystem durch eine für Makromoleküle durchlässige Membran von NK Zellen getrennt. Eine Inkubation mit P. carinii induzierte keine Produktion von IFN-g. Nach einer Inkubation mit L. monocytogenes waren geringere IFN-g Konzentrationen zu beobachten, als in einer Kokultur mit der Möglichkeit eines direkten Membrankontaktes zwischen MF und NK Zellen. Die Beteiligung von löslichen, bislang unbekannten Mediatoren an der durch P. carinii-Organismen ausgelösten IFN-g Induktion konnte demnach ausgeschlossen werden. Die Rolle von zellständigen Antigenen bei der Induktion der IFN-g Produktion wurde durch Blockadeversuche mit monoklonalen Antikörpern untersucht. Eine Koinkubation von MF, NK Zellen und L. monocytogenes oder P. carinii in Gegenwart von Antikörpern gegen das F4/80 Molekül führte sowohl auf Ebene der mRNA als auch auf Proteinebene zu einer verringerten Bildung von IFN-g, IL-12 und TNF-a. Diese Daten wurden dahingehend interpretiert, daß der Antikörper das Antigen blockiert und somit eine Signalübertragung von MF zu NK Zellen verhindert. Die Stärke der F4/80 Expression hat keinen Einfluß auf die Produktion von IFN-g. Milzzellen von Mäusen hingegen, die aufgrund einer Mutation das F4/80 Antigen nicht exprimieren, konnten nach Inkubation mit L. monocytogenes weitaus weniger IFN-g bilden, als Tiere des Wildtyps. Die These eines membranabhängigen Signalweges zwischen MF und NK Zellen zur Induktion von IFN-g wurde dadurch erhärtet, daß gegen NK Zellen gerichtete monoklonale Antikörper generiert werden konnten, welche eine erregerinduzierte Produktion von IFN-g inhibierten. Die Daten dieser Arbeit weisen auf eine interzellulär wirksame Funktion des F4/80-Antigens hin und stellen damit die erste Funktionsbeschreibung dieses Moleküls dar. Weiterhin wird durch diese Arbeit zum ersten Mal eine Beteiligung membrangebundener Antigene an der mikrobiell induzierten IFN-g Produktion gezeigt. Es wird vermutet, daß ein membranabhängiger Signalweg zwischen MF und NK Zellen je nach Typ des Erregers entweder eine essenzielle (P. carinii) oder eine zumindest kostimulatorische Rolle (L. monocytogenes) besitzt.

Activation of macrophages (MF) by gamma-interferon (IFN-g) is an important step in cellular immune reactions against microbial pathogens. In the absence of T lymphocytes, production of IFN-g is initiated by cytokine-dependent interactions between MF and natural killer (NK) cells, triggered by the pathogen. We found that a) Listeria monocytogenes-triggered release of IFN-g was significantly reduced when cell contact between MF and NK cells was inhibited, and b) Cell contact between MF and NK cells was even prerequisite for IFN-g release when triggered by Pneumocystis carinii. This lead to the hypothesis that, in addition to cytokine-release, membrane associated mechanisms play a role in inducing NK-dependent IFN-g. First, we examined whether other soluble MF-derived factors contribute to the induction of IFN-g. Macrophages were incubated with L. monocytogenes or P. carinii organisms in the same well as purified NK cells but separated by a semipermeable membrane. While P. carinii organisms did not trigger any IFN-g release, L. monocytogenes triggered significantly lower amounts of IFN-g than either pathogen when cell contact was uninhibited. These and other results made it unlikely, that as yet unknown soluble MF products played a significant role in this system. Next, we investigated whether known MF surface antigens were involved by inhibition experiments with monoclonal antibodies (mAb). Co-incubation of MF, NK cells and L. monocytogenes or P. carinii with mAb against the F4/80 antigen inhibited the production of IFN-g, interleukin (IL)-12 and tumor necrosis- factor (TNF)-a, both on mRNA and on protein levels. These data were interpreted in that the mAb blocked F4/80,thereby preventing a necessary or accessory signaling between microbe-triggered MF and NK cells. The intensity of F4/80 expression on MF did not seem to affect IFN-g release in vitro. In contrast, spleen cells of gene-deleted F4/80 knock-out mice produced much less IFN-g in the presence of L. monocytogenes than spleen cells of wild-type mice. The hypothesis of a membrane-dependent signaling pathway between MF an NK cells was affirmed by the development of NK-specific mAb which also inhibited pathogen-triggered, T cell-independent IFN-g release. Our data suggest an intracellular regulatory role for F4/80. Although widely used as a cell marker, this is the first report on a function for this murine MF-specific antigen. Taken together, our work suggests a membrane-associated signaling pathway between MF and NK cells. Its relative importance in initiating natural cellular immune response mechanisms depends on the nature of primary microbial stimulus.