In der Produktion von Adeno-assoziierten Virus (AAV) Vektoren (rAAV) mittels Sf9-Insektenzell basierten Produktionssystemen (OneBac) können hohe rAAV-Ausbeuten erzielt werden, jedoch schwankt die Transduktionseffizienz je nach rAAV-Serotyp. Besonders gering zeigte sich die Infektiosität von rAAV5. Zudem fiel im Rahmen der OneBac-Publikation eine gegenüber Vergleichsvektoren aus HEK 293-Zellen gesteigerte rAAV Fremd-DNA-Verpackung auf. Ziel dieser Arbeit war deshalb die Herstellung stabiler Sf9-Zelllinien zur Produktion transduktionsoptimierter rAAV5 auf Basis eines erhöhten VP1-Anteils im rAAV5 Kapsid. Im Verlauf der Arbeit wurde die erhöhte Verpackung von Fremd-DNA auf die Rep-Bindestelle (RBE) der AAV-Replikationsgene (rep) und AAV-Kapsidgene (cap) beinhaltenden pIR-Plasmide zurückgeführt, sodass die weitere Zielsetzung in der Herstellung ebenfalls optimierter rAAV5 trotz RBE-Deletion bestand. Durch Klonierung eines artifiziellen Introns mit zusätzlichem Polyhedrin-Promoter konnte ein neuartiges pIR-Cap-AAV5-Intron-RBE+-Plasmid erstellt werden, welches mit pIR-Rep78-AAV2-hr2-RBE+ in Sf9-Zellen kotransfiziert wurde. Im Verlauf wurde RBE aus den pIR-Cap und pIR-Rep-Plasmiden deletiert und diese ebenfalls in Sf9-Zellen kotransfiziert. Nach Anzüchtung unter Blasticidin-Selektion, Ernte und Aufbereitung der rAAV5 wurden diese auf Expression der Kapsid- und Replikationsproteine mittels Western Blot, auf Vektorausbeute pro Sf9-Zelle mittels quantitativer PCR und auf Infektiosität mittels eines Transduktionsassays mit C12-Zellen untersucht. Der VP1-Anteil der rAAV5-Kapside konnte gegenüber den OneBac-rAAV5 deutlich gesteigert werden. Darüber hinaus gelang es rAAV5 mit hoher Vektorausbeute und gegenüber den Vergleichs-rAAV5 (OneBac) ca. 100-fach gesteigerter Infektiosität zu generieren. Trotz RBE-Deletion konnten ebenfalls hochinfektiöse ΔRBE-rAAV5 in hohem Maßstab hergestellt werden. Eine Optimierung des VP1-Anteils ist der Schlüssel zu einer erfolgreichen Produktion hoher Mengen, transduktionsoptimierter rAAV5 im Sf9-Zellproduktionssystem (OneBac2.0). Zudem beeinflusst eine RBE-Deletion nicht die Ausbeute und Transduktionseffizienz der gewonnenen rAAV5. Im Rahmen weiterer Experimente der OneBac2.0-Publikation zeigte sich nach RBE-Deletion eine minimale rAAV5-Fremd-DNA-Verpackung. Damit stellt das OneBac2.0-System das erste Insektenzell-basierte Produktionsmodell dar, das eine Herstellung hochinfektiöser rAAV5 in großem Maßstab mit minimaler Fremd-DNA garantiert und somit eine effiziente und sichere gentherapeutische Anwendung ermöglicht.
Production of recombinant adeno-associated virus vectors (rAAV) in Sf9-cell systems (OneBac) guarantees high levels of vectors though transduction potency varies according to rAAV-subtype. Especially rAAV5 shows low infectivity. Furthermore, rAAV produced with the OneBac-system showed enhanced encapsidation of foreign DNA compared to rAAV from HEK293-cells. Aim of this study was to boost rAAV5 infectivity with a new AAV5-capsid coding plasmid enhancing expression of VP1. Encapsidation of foreign DNA was associated to prevalence of Rep binding element (RBE) on pIR-plamids. Thus, we aimed to generate rAAV5 in large numbers with high infectivity despite deletion of RBE. The use of an artificial intron containing an additional polyhedrin promoter enabled cloning of a new pIR-Cap-AAV5-Intron-RBE+ plasmid which was cotransfected with pIR-Rep78-AAV2-hr2-RBE+ in Sf9-cells. In the course of the study RBE was deleted from pIR-Cap and pIR-Rep-plasmids and cotransfected in Sf9-cells, too. After blasticidin-controlled growth, harvest and preparation rAAV5 were analyzed by western blot analysis for expression of replication and capsid proteins, by quantitative PCR for vector generation per sf9 cell and by transduction assay for infectivity. In comparison to OneBac-rAAV5 VP1-levels of the novel rAAV5 capsids were significantly higher and infectivity could be boosted up to a 100-fold increase. Despite RBE-deletion ΔRBE-rAAV5 were generated in large numbers and showed high infectivity. Optimization of VP1-levels is the key to a production of highly infectious rAAV5 and deletion of RBE enables minimal encapsidation of foreign DNA as showed in further analysis (OneBac2.0-publication). OneBac2.0 is the first insect cell-based production system that guarantees high levels of highly infectious rAAV5 for efficient and safe clinical appliance.
