Apherese von CD34-positiven Vorläuferzellen unter Imatinibmesylat bei Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie in kompletter zytogenetischer Remission: Ein Modell für erfolgreiches In-vivo-Purging

Abstract

Die CML ist eine klonale Neoplasie der Hämatopoese, für die eine spezifische Chromosomen-Anomalie, das Philadelphia-Chromosom, charakteristisch ist. Das Philadelphia-Chromosom bildet durch reziproke Translokation der Chromosomen 9 und 22, t(9;22)(q34;q11), das BCR-ABL-Gen, durch welches das Fusionsprotein p210^BCR-ABL generiert wird. p210^BCR-ABL hat eine erhöhte und deregulierte Tyrosinkinaseaktivität, die zu gesteigerter Proliferation, reduziertem natürlichen Zelltod und verminderter Adhäsion der leukämischen Zellen am Knochenmarkstroma führt. Imatinib, ein 2-Phenylaminopyrimidinderivat, inhibiert selektiv die BCR-ABL-Tyrosinkinase, indem es kompetitiv die ATP- Bindungsstelle der Tyrosinkinase bindet. Der Tyrosinkinaseinhibitor verursacht dadurch in BCR-ABL+ Zellen einen Proliferationsstopp und die Reinduktion des programmierten Zelltodes. Die neuesten Daten der IRIS-Studie zeigen nach einer Beobachtungszeit von 60 Monaten zytogenetische Ansprechraten von 92% im Sinne eines MCR und von 87% mit CCR. Die herausragenden Remissionsraten haben die Prognose und das Therapiemanagement von CML-Patienten entscheidend beeinflusst. Dennoch können Resistenzen gegenüber Imatinib zum Rezidiv der Erkrankung führen. Die vorliegende Promotionsarbeit beschäftigt sich mit den therapeutischen Möglichkeiten, die sich durch Imatinib in Verbindung mit autoHSCT ergeben könnten. Dazu wurden im Zeitraum von 3 Jahren 18 CML- Patienten mit CCR über mehr als 6 Monate zur Separation CD34+ Zellen mit Filgrastim mobilisiert, ohne dabei die Therapie mit Imatinib zu unterbrechen. Während der Therapie und Mobilisation wurden sowohl Blut- und Knochenmarksproben als auch die Stammzellapheresate zytogenetisch und molekulargenetisch untersucht. Es wurden 8 Frauen und 10 Männer analysiert. 15 Patienten befanden sich initial in CP, 3 Patienten in AP. Die mittlere Erkrankungsdauer vor autoHSCT betrug 40,6 Monate (Range: 8-91 Monate), die mittlere Dauer der Imatinibtherapie bis zur Separation 16,2 Monate (Range: 6-27 Monate). Patienten in CP erhielten täglich 400 mg Imatinib, Patienten in AP 600 mg. Die Mobilisation erfolgte mit 2-mal täglich 5 µg/kg KG Filgrastim s.c. unter kontinuierlicher Imatinibtherapie. Mindestens 2,0x10^6/kg KG CD34+ Zellen wurden als erfolgreiche Apherese definiert. Die mittlere Anzahl peripherer CD34+ Zellen nach Mobilisation lag bei 2,8x10^6/kg KG (Range: 0,7-4,9x10^6/kg KG). Bei 2 Patienten erfolgte aufgrund einer zu geringen Anzahl der im peripheren Blut zirkulierenden CD34+ Zellen keine Stammzellsammlung. Bei 4 Patienten wurden weniger als 2,0x10^6/kg KG CD34+ Zellen gesammelt. Erfolgreich verlief die Apherese bei 12 Patienten (67%). Durchschnittlich konnten 3,2 x10^6/kg KG CD34+ Zellen (Range: 2,0-4,9x10^6/kg KG) gesammelt werden. 21 Proben der Apheresate von insgesamt 14 Patienten wurden molekulargenetisch analysiert. In der quantitativen PCR waren alle Proben BCR-ABL-negativ. Die qualitative konventionelle PCR war bis auf eine Probe ebenso BCR-ABL-negativ. 12 Proben (57%) waren auch in der nested PCR BCR-ABL-negativ. Insgesamt konnten von 7 Patienten BCR-ABL-negative CD34+ Zellen gesammelt werden. Der Vergleich der BCR-ABL-Ratio der Blut- und Knochenmarkproben vor und 1-2 Monate nach SCM zeigte keine statistisch signifikante Änderung im Wilcoxon-Test. Die Ergebnisse der qualitativen PCR waren bei 12 Patienten unverändert. Bei 2 Patienten zeigte sich eine Zunahme der BCR-ABL-PCR-Produkte, bei 2 Patienten war die nested PCR nach SCM BCR-ABL- negativ. Die vorliegende Arbeit demonstriert die Sicherheit und Effizienz autologer Stammzellsammlungen unter Imatinibtherapie bei CML-Patienten in CCR. Es konnten bei 12 Patienten erfolgreich Stammzellapheresate gesammelt werden. Bei 7 Patienten waren diese sogar BCR-ABL-negativ, was für ein erfolgreiches In-vivo-Purging sprechen könnte. Das Auftreten von durch Resistenzen bedingten Rezidiven erfordert die weitere frühzeitige Therapieoptimierung. Autologe Stammzellsammlungen und –transplantation könnten eine alternative, vorübergehende Therapieoption beim Auftreten von Rezidiven darstellen.

CML is characterized by the presence of the oncogenic t(9;22)(q34;q11) translocation known as the Philadelphia chromosome that generates the BCR-ABL fusion protein. Imatinib is a 2-phenylpyrimidine derivative that induces a complete cytogenetic response in 87% of patients with newly diagnosed Philadelphia chromosome positive CML by competitively blocking the ATP binding cleft of the BCR-ABL fusion protein. The notably high rate of complete cytogenetic responses has influenced the prognosis and management of CML patients. However, resistance to imatinib can cause relapse. The aim of this project was to reevaluate the place of autologous SCT in the imatinib era. To assess the possibility of stem cell mobilisation (SCM) during imatinib therapy G-CSF-induced SCM and subsequent leukapheresis were performed in 18 CML patients in CCR. During imatinib therapy and SCM peripheral blood, bone marrow and apheresis products were analysed by nested and quantitative RT-PCR and by fluorescence in situ hybridization (FISH). A total of 18 patients were investigated, 15 patients in chronic phase and three patients in accelerated phase. The male to female ratio was 10:8. The mean duration of CML before SCM was 40.6 months (range: 8-91 months) and the mean duration of imatinib therapy was 16.2 months (range: 6-27 months). In all patients a complete cytogenetic response was confirmed twice in consecutive cytogenetic analyses. Subsequently all patients were stimulated with 10 µg/kg BW G-CSF and continued imatinib therapy (400 mg imatinib daily in chronic phase patients and 600 mg imatinib daily in accelerated phase patients). A successful separation of ≥ 2.0x10^6/kg BW CD34+ cells could be achieved in 12 patients (67%) with a mean yield of 3.2 x10^6/kg BW CD34+ cells (range: 2.0-4.9x10^6/kg BW). The mean yield of CD34+ cells after a median of five days of G-CSF administration was 2.8x10^6/kg BW (range: 0.7-4.9x10^6/kg BW). Apheresis generated insufficient amounts in four patients with a harvest of <2.0x10^6 CD34+ cells/kg BW. The circulating CD34+ cells were <5/µl in two patients indicating unsuccessful mobilisation. 21 stem cell products from 14 patients were analysed by quantitative and qualitative PCR. All harvests were BCR-ABL-negative in quantitative RT-PCR. After first round qualitative RT-PCR, all but one stem cell products, were also BCR-ABL- negative. In contrast, the nested PCR was BCR-ABL-negative in 12 of 21 assays (57%). BCR-ABL-negative CD34+ cells could be generated in seven patients. A Wilcoxon signed-rank test indicating that differences in the mean peripheral blood and bone marrow BCR-ABL load prior to SCM compared to the mean value 1-2 months after SCM were not significant. The results of qualitative PCR prior to SCM and 1-2 months after SCM were unchanged. An increase of BCR-ABL transcripts after SCM was detected in two patients, while a decrease was detected in another two patients by negative nested PCR. This dissertation demonstrated the safety and efficacy of autologous stem cell apheresis under imatinib therapy in CML patients in CCR. Successful apheresis could be generated in 12 patients. Even seven BCR-ABL-negative stem cell products could be obtained suggesting that in vivo purging was successful. The incidence of relapse caused by resistance requires further studies to optimise the therapy of CML. Autologous stem cell apheresis and transplantation could be an alternative temporary therapeutic option at relapse.